过表达线粒体铁蛋白在由6-OHDA诱导的帕金森模型中的保护机制的研究

论文摘要

帕金森病是和年龄相关的神经退行性疾病,其特征是黑质多巴胺能神经元的特异性退行病变。一些神经毒剂如6-羟多巴胺（6-OHDA）可以在一些试验模型中模拟这一病理过程。研究表明,神经细胞内铁平衡紊乱和氧化应激与PD的病理过程密切相关。细胞质铁蛋白可以截获储存铁,因而可以保护细胞免受潜在的铁诱导的自由基损伤。线粒体铁蛋白（mitochondrial ferritin, MtFt）是2001年发现的一个定位在线粒体上的蛋白质,和细胞质铁蛋白的H链（H-ferritin）有很高的同源性,而且它们的亚铁氧化酶中心的氨基酸序列相当保守。其功能还不明了。最近的免疫组化研究结果表明,MtFt可以特异的在脑的皮质和脊髓神经细胞内表达,而这些区域是耗氧较多、代谢活性较高的区域。以前的研究表明,过表达MtFt可以造成细胞内铁的重新分布,导致细胞内铁缺乏,使得癌细胞对叔丁基过氧化氢造成的氧化损伤的敏感性增加。为了研究MtFt在6-OHDA诱导的PD细胞模型中的作用,我们在人的多巴胺能神经元SH-SY5Y中过表达鼠的MtFt,建立了MtFt-SY5Y和P10-3-SY5Y（空质粒对照）细胞系。实验中我们选择了6-OHDA诱导的SH-SY5Y、MtFt-SY5Y和P10-3-SY5Y细胞作为细胞模型,运用了MTT、流式细胞术、荧光显微成相,细胞免疫荧光和蛋白质杂交等方法研究了氧化应激状态下MtFt-SY5Y细胞的凋亡特性。结果如下:（1）成功的将MtFt基因转入到神经细胞SH-SY5Y中,建立了MtFt-SY5Y和P10-3-SY5Y细胞系,发现过表达MtFt可以显著的抑制细胞的生长,这可能是由于胞质内铁缺失造成的。（2） MtFt的表达抑制了由6-OHDA造成的细胞内活性氧（reactive oxygen species ROS）、钙离子和脂质过氧化水平的增加,细胞线粒体膜电位（ΔΨm）的下降。与对照组相比,这些指标差异显著（p<0.01）。（3）一个有趣的现象是,MtFt的表达上调了诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase iNOS）的表达,造成细胞内NO浓度显著升高。与野生型SH-SY5Y或转空质粒P10-3-SY5Y细胞相比,NO增加了两倍多,差异极其显著（p<0.01）。（4） MtFt的表达保护了线粒体复合物I的酶活性,经6-OHDA处理的P10-3-SY5Y细胞与对照组相比,其线粒体复合物I的酶活力下降了约70%,而经6-OHDA处理的MtFt-SY5Y细胞,其线粒体复合物I的酶活力仅降低了约20%,统计结果表明,其差异极其显著（p<0.01）。（5）应用细胞免疫荧光技术和Western blot均证明了MtFt的表达抑制了细胞色素C的释放。（6） MtFt的表达显著的抑制了由6-OHDA诱导的LIP的升高,经6-OHDA处理的P10-3-SY5Y细胞,其胞内的LIP与对照组相比增加了150%,而MtFt-SY5Y细胞经相同条件处理后,于对照组相比,其LIP仅增加了约50%,统计结果显示,差异显著（p<0.01）。（7）核染色技术和流式细胞分析技术都证明了MtFt的表达抑制了由6-OHDA引起的细胞凋亡。SH-SY5Y和P10-3-SY5Y细胞经药物处理后凋亡率分别为70%和67%左右,而MtFt-SY5Y的凋亡率仅为10左右%,统计结果显示,其差异极其显著（p<0.01）。（8） Wester blot研究发现, MtFt的表达降低了Bax的表达,对于MtFt-SY5Y细胞,Bcl-2、ferritin、TfR和NF-kB的表达水平无论是用药物处理还是不用药物处理都没有显著变化。相反,对于P10-3-SY5Y细胞,这些检测指标都发生了显著变化。结论:本论文首次将MtFt转染到神经细胞SH-SY5Y中,在6-OHDA诱导的PD细胞模型上,研究了MtFt在氧化应激状态下的功能以及铁代谢和PD的关系。本研究结果首次证明,MtFt在保护神经细胞线粒体免受由6-OHDA诱导引起的氧化损伤中具有重要的保护作用。其机制可能是通过调节铁的代谢,抑制Fenton反应,从而减少活性氧和过氧亚硝基的生成,降低脂质过氧化水平,防止线粒体膜电位崩溃,保持细胞内钙离子平衡,阻止LIP的增加和细胞色素C的释放,抑制凋亡信号通路上促凋亡蛋白的表达,维持抗凋亡蛋白的表达等多途径而起到对细胞的保护作用的。尽管MtFt上调了iNOS的表达,增加了细胞内NO的水平,但是由于ROS的产生减少,所以ROS和NO反应产生的过氧亚硝基也会减少,从而阻抑了由6-OHDA诱导的通过ROS/NO途径对细胞引起的凋亡信号通路,而起到对细胞的保护作用。调节MtFt在神经细胞中的表达可以十分有效的防止PD的发生,显著的阻抑由神经毒素引起的神经细胞凋亡,起到神经保护的作用。本研究结果对于人们深入了解PD的致病机理和今后的有效治疗都具有重要的意义。由于MtFt属于内源性蛋白,所以它的表达不会对机体产生副作用,因此深入了解并掌握MtFt的调控机制应当成为今后工作的重点,我们的工作对于PD的治疗和预防提供了一种新的有效策略。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略表
• 引言
• 第一章 文献综述——帕金森病的致病机理及研究进展
• 1.1 造成PD 的遗传因素
• 1.1.1 PARK1（α-Synuclein）
• 1.1.2 PARK2 （PARKIN）
• 1.1.3 DJ-1
• 1.1.4 PINK1
• 1.1.5 LRRK2
• 1.2 造成PD 的环境因素-氧化应激与帕金森病
• 1.2.1 氧化应激的证据
• 1.2.2 铁与氧化应激
• 1.3 细胞质铁蛋白和线粒体铁蛋白
• 1.3.1 细胞质铁蛋白（cytosolic ferritin）
• 1.3.2 线粒体铁蛋白（mitochondrial ferritin,MtFt）
• References
• 第二章 过表达线粒体铁蛋白在由6-OHDA 诱导的帕金森模型中的保护机制的研究
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 细胞培养、转染及阳性单克隆的筛选
• 2.2.3 用MTT 法测定细胞活力及细胞生长状况
• 2.2.4 用荧光显微镜观察细胞核形态变化
• 2.2.5 用PI 单染流式细胞术检测细胞凋亡
• 2.2.6 细胞内活性氧的测定
• 2.2.7 线粒体膜电位的测定
• 2.2.8 细胞内钙离子浓度的测定
• 2.2.9 细胞内NO 的测定
• 2.2.10 细胞内脂质过氧化损伤测定
• 2.2.11 用细胞免疫荧光法检测细胞色素C 的释放
• 2.2.12 细胞内LIP（liable iron pool）的检测
• 2.2.13 线粒体复合物I 活力的测定
• 2.2.14 Western Blot 检测MtFt、Bcl-2、Bax、ferritin、cytochrome C. Inos.T fR 和NF-kB 的表达
• 2.2.15 数据统计及分析
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 单克隆MtFt 转染筛选鉴定、细胞活力和细胞生长的测定
• 2.3.2 MtFt 对细胞内活性氧和NO 产生的影响
• 2.3.3 MtFt 对细胞对细胞线粒体膜电位的影响
• 2.3.4 细胞内钙离子的变化
• 2.3.5 MtFt 对脂质过氧化的作用
• 2.3.6 MtFt 对细胞铁库内铁含量的影响
• 2.3.7 MtFt 对线粒体复合物I（complexI）活力的影响
• 2.3.8 荧光显微镜观察细胞核形态的变化
• 2.3.9 PI 单染-流式细胞分析（FACS analysis）细胞凋亡率
• 2.3.10 细胞免疫荧光观察细胞色素C 的释放
• 2.3.11 western blot 检测细胞内MtFt、Bcl-2、Bax、TfR、ferritin
• 2.4 讨论
• 结论
• 本研究的主要创新点
• References
• 发表和待发表的论文
• 致谢