CmbZIP-like和CmAPP基因在盾壳霉发育和产孢过程中的功能分析

论文摘要

盾壳霉（Coniothyrium minitans）是核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）的重寄生真菌,对作物菌核病有显著控制作用。分生孢子是盾壳霉存活、寄生和传播的主要形式,同时也是盾壳霉生防制剂的主要成分,在盾壳霉生长发育的重要环节起重要作用。研究和理解盾壳霉分生孢子形成的调控信号具有重要的理论意义和实践价值。本文以盾壳霉ZS-1菌株T-DNA插入标记的产孢缺陷型突变体ZS-1T11329和ZS-1T21656为材料,对它们的生物学性状和分子生物学性状进行了系统的研究,结果如下：突变体ZS-1T11329在PDA上不能产生分生孢子器,生长速度明显快于ZS-1,菌丝分支增多,寄生致腐核盘菌菌丝、菌核能力有所下降,核盘菌菌丝、菌核不能恢复其产孢性状,但是部分突变体如ZS-1T21656可以恢复其产孢,产生的分生孢子与ZS-1孢子的形态一致,能够正常萌发生长,证明ZS-1T11329的产孢可以恢复。突变体ZS-1T21656不能产生分生孢子器；菌丝尖端弯曲,分支短而多；生长速度、寄生致腐菌核能力与ZS-1无明显差异；寄生核盘菌菌丝能力下降,产抗真菌物质能力增强。Southern杂交证实T-DNA标记在突变体ZS-1T11329和ZS-1T21656中均为单拷贝插入。突变体ZS-1T11329中T-DNA插入在一编码区为793bp的基因的启动子区域,该基因的推定蛋白与碱性亮氨酸拉链（bZIP）转录因子蛋白具有同源性,故将其基因命名为CmbZIP-like;突变体ZS-1T21656中T-DNA:插入在一编码区1993bp的基因的启动子区域,该基因的推定蛋白与氨酰基脯氨肽酶具有高度同源性,并含有其保守结构域APP,故命名基因为CmAPP。CmbZIP-like和CmAPP基因在ZS-1基因组内均为单拷贝。利用敲除、互补的方法,农杆菌介导转化（ATMT）技术对以上基因的功能进行了研究。构建了CmbZIP-like基因和CmAPP基因的敲除载体,分别利用ATMT技术转化ZS-1；得到了CmAPP基因的敲除转化子,通过其生物学性状研究发现该基因对盾壳霉生长发育无显著影响；多次试验未得到CmbZIP-like基因的敲除转化子,故考虑对ZS-1T11329进行CmbZIP-like基因互补实验,已构建完互补载体,目前正在进行ATMT。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 核盘菌及其重寄生菌盾壳霉的研究进展
• 1.1 核盘菌及其所引发的植物病害
• 1.1.1 核盘菌的分类及危害
• 1.1.2 作物菌核病的防治
• 1.2 重寄生真菌盾壳霉
• 1.2.1 盾壳霉分类地位及分布
• 1.2.2 盾壳霉的生物学特性
• 1.2.3 盾壳霉的生态学特性
• 1.2.4 盾壳霉对核盘菌的生防机制
• 2 真菌分生孢子形成机理的研究进展
• 2.1 真菌分生孢子的重要性
• 2.2 真菌分生孢子形成的分子机理的研究
• 2.3 盾壳霉分生孢子发育的分子调控研究
• 3 真菌基因功能研究的技术
• 3.1 确定候选研究基因
• 3.2 基因的功能验证
• 4 碱性亮氨酸拉链研究进展
• 5 氨酰基脯氨酸二肽酶研究进展
• 6 本研究的立题依据和目的与意义
• 第二章 ZS-1T11329和ZS-1T21656生物学性状的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 引物
• 1.2 方法
• 1.2.1 ZS-1T11329和ZS-1T21656的形态特征观察
• 1.2.2 ZS-1T11329和ZS-1T21656菌丝生长速度的测定
• 1.2.3 ZS-1T11329和ZS-1T21656寄生菌丝能力测定
• 1.2.4 ZS-1T11329和ZS-1T21656寄生致腐核盘菌菌核能力测定
• 1.2.5 ZS-1T11329和ZS-1T21656共培养产孢及孢子的形态观察
• 1.2.6 单孢菌株的生物学验证
• 1.2.7 单孢菌株的分子生物学验证
• 1.2.8 盾壳霉对ZS-1T11329和ZS-1T21656产孢的影响
• 1.2.9 菌核PDA、胡萝卜PDA上突变体的形态特征
• 2 结果与分析
• 2.1 ZS-1T11329和ZS-1T21656的形态特征观察
• 2.2 ZS-1T11329和ZS-1T21656的菌丝生长速度
• 2.3 ZS-1T11329和ZS-1T21656产抗真菌物质及寄生菌丝的能力
• 2.4 ZS-1T11329和ZS-1T21656寄生致腐菌核能力
• 2.5 ZS-1T11329和ZS-1T21656共培养产孢及孢子形态
• 2.6 单胞菌株的生物学验证
• 2.7 单胞菌株的PCR验证
• 2.8 盾壳霉对ZS-1T11329和ZS-1T21656产孢的影响
• 2.8.1 灭活盾壳霉菌丝对ZS-1T11329和ZS-1T21656产孢的影响
• 2.8.2 盾壳霉发酵液对ZS-1T11329和ZS-1T21656产孢的影响
• 2.9 菌核PDA、胡萝卜PDA不能恢复ZS-1T11329、ZS-1T21656产孢
• 3 结论和讨论
• 3.1 结论
• 3.2 讨论
• 第三章 盾壳霉产孢相关基因的分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株、载体
• 1.1.2 培养基、抗生素
• 1.1.3 试剂
• 1.1.4 限制性内切酶及其它酶类、试剂盒
• 1.1.5 DNA分子量标记
• 1.2 方法
• 1.2.1 Souther杂交分析突变体中T-DNA的插入位点数
• 1.2.2 T-DNA插入位点基因的分析
• 1.2.3 Real time PCR检测基因的表达情况
• 2 结果与分析
• 2.1 Southern杂交分析突变体中T-DNA的插入位点数
• 2.2 T-DNA插入位点基因的分析
• 2.2.1 ZS-1T11329 T-DNA插入位点处基因的分析
• 2.2.2 ZS-1T21656 T-DNA插入位点处基因的分析
• 2.3 Real time PCR检测突变体内基因表达
• 3 结论和讨论
• 3.1 结论
• 3.2 讨论
• 第四章 盾壳霉产孢相关基因的功能验证
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株、载体、及酶类
• 1.1.2 抗生素
• 1.1.3 试剂及培养基
• 1.2 方法
• 1.2.1 CmbZIP-like基因的功能验证
• 1.2.2 CmAPP基因功能的验证
• 2 结果与分析
• 2.1 CmbZIP-like基因的功能研究
• 2.1.1 CmbZIP-like基因敲除载体的构建及验证
• 2.1.2 ATMT及敲除转化子的PCR验证
• 2.1.3 CmbZIP-like基因互补载体的构建及ATMT
• 2.2 CmAPP基因的功能研究
• 2.2.1 CmAPP基因敲除载体的构建及验证
• 2.2.2 CmAPP基因敲除转化子的PCR验证
• 2.2.3 RT-PCR验证CmAPP基因敲除转化子中该基因的表达
• 2.2.4 CmAPP基因敲除转化子的生物学特性
• 3 结论和讨论
• 3.1 结论
• 3.2 讨论
• 结论和展望
• 参考文献
• 致谢