论文摘要
山核桃(Carya cathayensis Sarg.)是我国特有干果和木本油料树种,主要分布在浙皖交界天目山系29°～31°N, 118°～120°E,浙西北山区近7万农户从事山核桃生产经营,70%以上的收入来源于山核桃。研究山核桃分子标记和克隆开花相关基因及其启动子,为其良种选育提供新的理论基础和途径,为培育缩短童期提早开花结实的新品种奠定分子育种基础,对该重要经济树种改良具有重要理论和实际意义。本文利用RAPD分子标记技术分析中国山核桃属6种植物间亲缘关系、5个山核桃和3个大别山山核桃天然种群遗传多样性;利用AFLP技术分析山核桃与薄壳山核桃杂交F1代的遗传变异;以常规分子生物学技术和锚定PCR技术分别克隆山核桃开花基因CcLFY及其启动子,并在GenBank注册,主要结果如下:1、中国山核桃属6种植物间亲缘关系研究表明:20个引物共扩增检测到317条谱带,平均每个引物扩增15.58条,其中271条谱带表现出多态性,占总带数的85.5%。POPGEN32软件分析显示:山核桃属6种植物间,遗传距离最小为0.2216,存在于山核桃和湖南山核桃之间,表明二者亲缘关系最近;遗传距离最大为0.5440,存在于湖南山核桃与薄壳山核桃之间,表明两者亲缘关系最远。5个山核桃树种天然群体和3个大别山山核桃天然群体RAPD分析表明:20对10bp随机引物扩增共检测到252条和238条谱带,其中多态带为168和162条,占66.7%和68.1%。遗传多样性分析结果显示:Shannon多样性指数为0.4102和0.4761,说明60.32%和58.18%的变异分布于群体内,而种群间变异占39.68%和41.82%,表明种群内有较丰富的遗传变异;这为良种选育提供了理论依据。2、利用AFLP技术对山核桃与薄壳山核桃授粉子代进行了分析,结果表明:父本与母本和子代之间有明显的差异,但母本与子代之间没有存在任何差异。3、我们根据已注册的开花调控关键基因LEAFY(LFY)同源基因的保守序列设计特异性引物,克隆到山核桃LFY同源基因片段基础上,以3’和5’RACE克隆获得山核桃LFY同源基因CcLFY全长cDNA,1442bp,已在GenBank注册,注册号为DQ989225。其中,开放阅读框(ORF) 1158 bp,编码385个氨基酸(包括起始密码子ATG)和一个终止密码子TAA,推测其分子量为43.5KD。cDNA序列中包含有脯氨酸富集区、中央酸性域、亮氨酸拉链结构及由赖氨酸和精氨酸残基形成的碱
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摘要ABSTRACT缩写词英汉对照引言1 文献综述1.1 山核桃研究简况1.1.1 山核桃生物学特性研究1.1.2 山核桃高效培育技术研究1.1.3 山核桃连年丰产技术研究1.1.4 山核桃生产上存在的问题及研究展望1.2 分子标记技术研究进展1.3 植物成花基因研究进展1.3.1 植物成花相关基因研究进展1.3.1.1 控制成花转变的路径1.3.1.2 植物花发育的基因1.3.2 LFY 同源基因的研究进展1.3.2.1 LFY 同源基因的克隆与结构分析1.3.2.2 LFY 同源基因的时空表达1.3.2.3 LFY 基因在成花各阶段中的作用1.3.2.4 与 LFY 基因相关的基因调控网络1.3.2.5 影响 LFY 基因表达的生理因子1.4 植物启动子研究进展1.4.1 植物基因启动子的一般特征1.4.1.1 转录起始位点1.4.1.2 TATA-box1.4.1.3 G-box1.4.1.4 CAAT box1.4.2 植物组织特异性启动子1.4.2.1 根特异性表达启动子1.4.2.2 茎特异性表达启动子1.4.2.3 叶特异性表达启动子1.4.2.4 花粉（花药）特异性启动子1.4.2.5 果实、种子特异性启动子1.4.2.6 维管束特异性表达启动子1.5 讨论1.6 本研究的总体思路2 山核桃种群 RAPD 分析2.1 实验材料与方法2.1.1 实验材料2.1.1.1 实验试剂2.1.1.2 实验材料2.1.2 实验方法2.1.2.1 山核桃基因组 DNA 提取及检测2.1.2.2 RAPD 反应体系优化2.1.2.3 引物筛选2.1.2.4 山核桃属植物种间亲缘关系 RAPD 分析2.1.2.5 山核桃种群遗传多样性 RAPD 分析2.1.2.6 大别山山核桃种群遗传多样性 RAPD 分析2.1.2.7 数据处理与统计分析2.2 结果与分析2.2.1 基因组 DNA 提取方法比较2.2.2 PCR 反应体系及条件优化2.2.2.1 Taq 酶、dNTP、引物浓度试验2+、DNA 模板浓度筛选'>2.2.2.2 Mg2+、DNA 模板浓度筛选2.2.2.3 增效剂 BSA 和 TmAc 筛选2.2.2.4 循环扩增条件筛选2.2.3 RAPD 引物筛选2.2.4 山核桃属种间 RAPD 结果2.2.4.1 RAPD 多态性分析2.2.4.2 遗传距离聚类分析2.2.5 山核桃种群 RAPD 结果2.2.5.1 多态位点百分比及其分布2.2.5.2 Shannon 表型多样性指数2.2.5.3 种群遗传分化指数2.2.5.4 种群间遗传一致度和遗传距离2.2.6 大别山山核桃种群 RAPD 结果2.2.6.1 多态位点百分比及其分布2.2.6.2 不同种群的遗传多样性2.2.6.3 种群间遗传一致度和遗传距离2.3 讨论3 山核桃与薄壳山核桃授粉子代 AFLP 分析3.1 实验材料与方法3.1.1 实验材料3.1.1.1 AFLP 实验材料3.1.1.2 AFLP 实验试剂3.1.2 实验方法3.1.2.1 子代果实质量测定3.1.2.2 子代果实品质测定3.1.2.3 子代AFLP 实验3.2 结果与分析3.2.1 授粉子代品质性状分析3.2.2 AFLP 实验结果3.3 讨论4 山核桃开花基因 CcLFY 克隆4.1 实验材料与方法4.1.1 实验材料4.1.1.1 实验材料4.1.1.2 酶和试剂4.1.1.3 引物合成和序列测定4.1.2 实验方法4.1.2.1 采样时间的确定4.1.2.2 山核桃CcLFY 基因片段的克隆4.1.2.3 山核桃CcLFY 基因3’端序列4.1.2.4 山核桃CcLFY 基因5’端序列4.1.2.5 山核桃CcLFY 基因全长cDNA4.1.2.6 山核桃CcLFY 基因转录区序列4.1.2.7 Southern Blotting 分析4.2 结果与分析4.2.1 雌花芽分化过程中的显微观察4.2.2 山核桃基因组DNA 提取4.2.3 山核桃CcLFY 基因阳性片段4.2.3.1 PCR 扩增结果4.2.3.2 序列测定与分析4.2.4 RNA 提取4.2.5 mRNA 的纯化4.2.6 3’端序列4.2.7 5’端序列4.2.8 cDNA 完整开放阅读框4.2.9 山核桃CcLFY 基因的结构分析4.2.10 CcLFY 基因转录区序列4.2.11 Southern Blotting 结果4.3 讨论5 山核桃CcLFY 基因时空表达与表达载体构建5.1 实验材料与方法5.1.1 实验材料5.1.1.1 植物材料5.1.1.2 质粒和菌株5.1.1.3 酶和试剂5.1.2 实验方法5.1.2.1 CcLFY 基因空间表达分析5.1.2.2 CcLFY 基因表达载体的构建5.1.2.3 叶盘法转化烟草外植体5.2 结果与分析5.2.1 CcLFY 基因空间表达特性研究5.2.2 CcLFY 基因表达载体的构建5.2.2.1 中间载体的构建5.2.2.2 CcLFY 基因表达载体构建5.2.2.3 CcLFY 基因表达载体的鉴定5.2.2.4 表达载体的农杆菌转化5.2.2.5 转基因烟草植株的培育5.3 讨论6 山核桃 CcLFY 基因启动子克隆与瞬时表达分析6.1 材料与方法6.1.1 试验材料6.1.1.1 植物材料与试剂6.1.1.2 菌种与载体6.1.2 试验方法6.1.2.1 山核桃 CcLFY 基因启动子克隆与序列分析6.1.2.2 山核桃 CcLFY 基因启动子表达载体的构建6.1.2.3 山核桃 CcLFY 基因启动子瞬时表达分析6.2 结果与分析6.2.1 山核桃 CcLFY 基因启动子克隆与序列分析6.2.1.1 第一次步移结果6.2.1.2 第二次步移6.2.1.3 第三次步移6.2.1.4 全长启动子的扩增结果6.2.1.5 启动子序列分析6.2.1.6 顺式作用元件的分析6.2.2 CcLFY 基因启动子表达载体的构建6.2.2.1 中间载体的构建6.2.2.2 表达载体的构建6.2.2.3 表达载体的鉴定6.2.3 CcLFY 基因启动子表达载体转入农杆菌6.2.4 CcLFY 基因启动子瞬时表达6.3 讨论7 结论7.1 结论7.2 后续研究计划参考文献附录1附录2附录3附录4个人简介导师简介1导师简介2成果目录清单致谢
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标签：山核桃论文; 基因论文; 启动子论文; 克隆论文; 表达载体构建论文;
山核桃分子标记与开花基因CcLFY及其启动子克隆的研究
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