立体选择性腈水解酶催化合成光学纯扁桃酸衍生物

论文摘要

光学纯扁桃酸衍生物,是重要的医药中间体和化学试剂,如R-邻氯扁桃酸是合成抗血小板凝聚药物的重要中间体,利用腈水解酶的立体选择性,可以得到一些化学反应无法合成的物质。本论文的目标是通过立体腈水解酶作为催化剂,水解扁桃腈衍生物,得到光学纯的扁桃酸衍生物,对所筛选到的菌株进行培养条件和转化条件优化等研究,为工业化应用奠定理论基础。论文首先通过HPLC的探索我们建立了三种衍生物的分析方法,以及采用催化剂酯化法及OD-H手性柱建立三种衍生物的手性分析方法,分离度达到1.5以上。然后通过筛选得到一株遗传稳定的菌株Alcaligenes faecalis ZJUTB10,利用这株实验室己有的菌株,进行催化合成光学纯扁桃酸衍生物的研究。通过单因素优化腈水解酶的培养基组分及各组分浓度和诱导剂的种类,以邻氯扁桃腈为腈水解酶催化的底物来优化,确定较适宜的培养基组成（g/l）:柠檬酸铵10,酵母膏10,正丁腈3.0,磷酸氢二钾5,氯化钠1,硫酸镁0.2。优化组分后对其生长产酶的条件也同样进行了优化,得出适合的培养条件为:温度30℃,装液量100ml/500ml,接种量6%（v/v）,在此条件下培养26h,邻氯扁桃腈酶活力达到最大值150.2U/g,生物量为4g/l。论文考察了静息细胞催化外消旋扁桃腈衍生物过程中转化条件对酶活力的影响。结果表明,催化邻氯扁桃腈较适宜的转化条件:pH7.5-8.0磷酸盐缓冲液,转化温度40℃,细胞浓度0.75mg/ml,底物浓度20mM,反应条件下8h后转化率为86.4%,e.e.值到达60.0%,在40mM的底物浓度产生底物抑制。催化间氯扁桃腈较适宜的转化条件:pH8.5磷酸缓冲液,转化温度30℃,细胞浓度1.0mg/ml,底物浓度20mM,反应条件下3.5h后转化率为92.0%,e.e.值达到98.7%,在40mM的底物浓度产生底物抑制。催化对氯扁桃腈较适宜的转化条件:pH8.0磷酸缓冲液,转化温度40℃,细胞浓度0.75mg/ml,底物浓度20mM,反应条件下3h后转化率为93.2%,e.e.值达到99%,在50mM的底物浓度产生底物抑制。对酶促反应动力学研究得到邻氯扁桃腈最大反应速率Vmax=10.59mM/min,米氏常数Km=9.47mmol/l;间氯扁桃腈最大反应速率Vmax=8.69mM/min,米氏常数Km=6.79mmol/L;对氯扁桃腈的最大反应速率Vmax=6.33mM/min,米氏常数Km=4.06mmol/l。在两相体系中,以邻氯扁桃腈为代表,优化得到最优的反应条件为:水:有机相（70:30,v/v）,温度30℃,磷酸缓冲液pH8.0,采用异辛烷为有机溶剂,其反应酶活达到151.44U/g,S构型e.e.值达到99%。而对于间氯扁桃腈和对氯扁桃腈,有机溶剂影响不大甚至不利于R构型产物的获得。对比扁桃酸及其衍生物得出,电位效应及空间位阻的影响,对于其催化效率及选择性的影响是显著的,其不同底物的亲和性也可以间接验证这一位阻效应的结果:邻氯扁桃腈>间氯扁桃腈>对氯扁桃腈>扁桃腈。尤其是邻氯扁桃腈存在较大的空间位阻效应,这也是其催化活力相对不高的原因之一。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 腈水解酶
• 1.2 腈水解酶机理
• 1.3 腈水解在有机合成中的作用
• 1.3.1 脂肪腈或芳基脂肪腈的生物转化
• 1.3.2 芳腈的生物转化
• 1.3.3 脂环腈和杂环腈的生物转化
• 1.3.4 水-有机溶剂体系中腈的酶促水解
• 1.4 邻氯扁桃酸
• 1.4.1 不对称合成法
• 1.4.1.1 手性醇氰酶-化学法
• 1.4.1.2 腈水解酶法
• 1.4.1.3 不对称还原法
• 1.4.1.4 化学合成法
• 1.4.2 光学异构体拆分法
• 1.4.2.1 外消旋邻氯扁桃酸合成
• 1.4.2.2 外消旋邻氯扁桃酸拆分
• 1.4.2.2.1 非对映体盐法拆分
• 1.4.2.2.2 酶法拆分
• 1.4.2.2.3 色谱法拆分
• 1.4.2.2.4 分子印迹法拆分
• 1.4.2.2.5 毛细管电泳法拆分
• 1.5 本文研究内容
• 参考文献
• 第二章 分析方法的建立与菌种筛选
• 2.1 引言
• 2.2 分析方法建立与菌种的筛选
• 2.2.1 材料与方法
• 2.2.1.1 化学试剂与主要仪器
• 2.2.1.2 培养基
• 2.2.1.3 酶活定义及浓度检测方法
• 2.2.1.4 手性检测方法
• 2.2.1.5 分离度
• 2.2.1.6 菌种筛选
• 2.2.2 结果与讨论
• 2.2.2.1 扁桃酸衍生物浓度检测
• 2.2.2.2 手性分析方法的建立
• 2.2.2.3 菌种的筛选
• 2.3 小结
• 参考文献
• 第三章 产碱杆菌ALCALIGENES FAECALIS催化邻氯扁桃腈为底物的产酶条件优化
• 3.1 引言
• 3.2 培养基组分及培养条件优化
• 3.2.1 材料与方法
• 3.2.1.1 菌种
• 3.2.1.2 培养基
• 3.2.1.3 细胞培养条件
• 3.2.1.4 生物量测定方法
• 3.2.1.5 全细胞转化条件
• 3.2.1.6 分析方法及酶活定义
• 3.2.2 结果与讨论
• 3.2.2.1 诱导剂种类对菌体生长以及产酶的影响
• 3.2.2.2 碳源种类和浓度对菌体生长及产酶的影响
• 3.2.2.3 氮源种类及浓度对菌体生长和产酶的影响
• 3.2.2.4 装液量对菌体生长以及产酶的影响
• 3.2.2.5 接种量对菌体生长以及产酶的影响
• 3.2.2.6 菌体生长及产酶曲线
• 3.3 小结
• 参考文献
• 第四章 转化条件优化
• 4.1 引言
• 4.2 转化条件的影响
• 4.2.1 材料与方法
• 4.2.1.1 菌种
• 4.2.1.2 培养基
• 4.2.1.3 细胞培养条件
• 4.2.1.4 不同pH转化条件
• 4.2.1.5 不同缓冲液的选择
• 4.2.1.6 温度对反应的影响
• 4.2.1.7 金属离子对催化反应的影响
• 4.2.1.8 细胞浓度、底物浓度对催化反应的影响
• 4.2.1.9 反应动力学
• 4.2.1.10 两相催化中不同有机溶剂种类对转化的影响
• 4.2.1.11 两相催化体系配比、pH、温度和进程曲线
• 4.2.1.12 不同有机溶剂对间氯扁桃腈和对氯扁桃腈底物的影响
• 4.2.1.13 底物特异性研究
• 4.2.1.14 1L反应器中转化条件
• 4.2.1.15 分析方法及酶活定义
• 4.2.2 结果与讨论
• 4.2.2.1 静息细胞催化
• 4.2.2.1.1 pH对转化的影响
• 4.2.2.1.2 不同缓冲液的选择
• 4.2.2.1.3 温度对反应的影响
• 4.2.2.1.4 金属离子对催化反应的影响
• 4.2.2.1.5 细胞浓度对反应的影响
• 4.2.2.1.6 底物浓度对反应的影响
• 4.2.2.1.7 反应动力学
• 4.2.2.2 两相体系的影响
• 4.2.2.2.1 两相催化中不同有机溶剂种类对转化的影响
• 4.2.2.2.2 不同配比的两相体系对转化的影响
• 4.2.2.2.3 不同pH值对两相体系转化的影响
• 4.2.2.2.4 不同温度对两相体系转化的影响
• 4.2.2.2.5 两相体系进程曲线
• 4.2.2.2.6 不同有机溶剂对间氯扁桃腈和对氯扁桃腈底物的影响
• 4.2.2.3 底物特异性的研究
• 4.2.2.3.1 不同取代基对于酶活性及选择性的影响
• 4.2.2.3.2 不同底物的动力学参数
• 4.2.2.4 R-邻氯扁桃酸、R-间氯扁桃酸、R-对氯扁桃酸反应器中产物的合成与提取
• 4.2.2.4.1 1L反应器中双菌耦联的催化
• 4.2.2.4.2 产物的分离提取
• 4.3 小结
• 参考文献
• 第五章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表论文及专利情况
• 附录