苹果茎痘病毒的鉴定及其外壳蛋白基因的原核表达

论文摘要

苹果茎痘病毒（Apple stem piHing virus,ASPV）是苹果和梨树上普遍发生的一种潜隐性病毒,广泛分布于世界各苹果和梨种植区。在砧木感病时该病毒可引起树体的严重衰退,对果树生长、产量和果品质量等造成严重的影响。栽培无病毒种苗是解决苹果和梨上ASPV危害的有效途径,病毒检测是培育和繁殖无病毒苗木的重要环节。本研究采用生物学、分子生物学等方法对来源于砂梨（Pyrus pyrifolia）的P-HH和P-3-2-67及来源于葡萄的G-L3共3个样品进行了ASPV检测和鉴定。通过采用汁液摩擦接种的方法从葡萄上分离获得分离株G-L3,经生物学表现分析、病毒粒子形态电镜观察以及序列比较分析,确定来源于葡萄的分离物为ASPV。构建了来源于砂梨的ASPV的外壳蛋白（Coat protein,CP）基因原核表达载体,并成功诱导表达,制备了表达蛋白的特异性抗体。具体研究结果如下:1.通过汁液摩擦接种草本指示植物西方烟（Nicotiana occidentalis‘37B’）后,症状观察,两个来源于砂梨的分离物（P-HH、P-3-2-67）和一个来源于葡萄的分离物（G-L3）均显症明显:P-HH在接种叶片上表现凹陷坏死白斑,叶脉坏死,皱缩症状;P-3-2-67出现黑色斑点、叶脉坏死和支脉黄化;G-L3出现叶片褪绿斑点、黑色斑点和坏死症状。通过试管捕捉反转录PCR（Tube capture-reverse transcription PCR,TC-RT-PCR）对3个分离物进行扩增后,PCR产物经6%PAGE电泳后,3个分离物均在316bp处出现特异性条带。进一步提纯病毒和电镜观察,结果显示3个分离物的病毒粒子形态一致,均为弯曲的长线形病毒。由此,推测上述3个来源于砂梨和葡萄的分离物（P-HH、P-3-2-67和G-L3）均为ASPV。2.以P-HH、P-3-2-67和G-L3接种表现症状的西方烟为材料,通过TC-RT-PCR,对这3个分离物CP基因的部分序列（316 bp）进行了扩增、克隆与序列测定。经序列分析,3个分离物的扩增片段与本实验室前期从砂梨（Pyrus pyrifolia）获得的分离株P1同源性最高达98.4%,与国外报道的来自于杂种榲椁（Pyronia veitchii）上的分离株Quince同源性达93%,与来自于楹椁（Cydonia oblonga）的分离物N1最低为77.8%。3个分离物间的核苷酸序列也有一定差异,P-HH/P-3-2-67为99.1%、P-HH/G-L3为99.1%、G-L3/P-3-2-67为99.4%。由此,我们进一步判断来自于葡萄的分离物G-L3为ASPV,这是ASPV侵染葡萄首次发现。3.采用本实验室前期克隆获得的来源于梨树的ASPV分离物6-1-13的CP基因,根据其序列特征设计引物,并在两端加酶切位点,对该基因进行扩增、序列验证后,与载体pET-28a（+）连接构建了该基因的原核表达载体（pET-ASPV-CP）,在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中经IPTG诱导表达、表达产物经SDS-PAGE电泳和Western-blot分析,表明该CP基因在大肠杆菌中BL21（DE3）得到正确表达,融合蛋白大小约45 kDa,并且具有免疫原性。通过回收表达蛋白并免疫大耳白兔,制备了ASPV重组CP的多克隆抗体,间接ELISA测定其效价为1:1 000,Western-blot分析证明该抗体可与重组CP发生免疫反应。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
• 1.1 ASPV的生物学特性
• 1.1.1 ASPV的地理分布与寄主范围
• 1.1.2 ASPV的症状特点
• 1.1.3 ASPV的传播途径
• 1.2 ASPV的病毒粒子特性和细胞病理学
• 1.3 血清学及株系
• 1.4 ASPV的基因组结构和组成
• 1.5 ASPV的检测技术
• 1.5.1 指示植物检测
• 1.5.2 血清学检测
• 1.5.3 分子生物学检测
• 1.6 病毒抗血清的制备
• 1.6.1 以提纯病毒粒体为抗原制备抗体
• 1.6.2 以病毒CP基因体外表达产物为抗原制备抗体
• 1.7 病毒病害的防治
• 1.7.1 培育和栽培无病毒苗木
• 1.7.2 抗病毒转基因工程
• 1.8 研究的目的和意义
• 第二章 苹果茎痘病毒的生物学及分子生物学鉴定
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 样品来源
• 2.1.2 菌株及主要试剂
• 2.1.3 引物设计
• 2.2 研究方法
• 2.2.1 生物学鉴定
• 2.2.2 分子生物学检测
• 2.2.2.1 反转录合成cDNA
• 2.2.2.2 PCR扩增
• 2.2.2.3 PCR产物的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测（PAGE）
• 2.2.3 病毒粒子形态观察
• 2.2.3.1 镁-皂土悬浮液的制备
• 2.2.3.2 病毒提纯方法
• 2.2.3.3 电镜观察
• 2.2.4 基因克隆
• 2.2.4.1 目的片段的扩增
• 2.2.4.2 目的片段的回收
• 2.2.4.3 载体的连接
• 2.2.4.4 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.4.5 热击转化大肠杆菌DH10B感受态细胞
• 2.2.4.6 阳性克隆的鉴定
• 2.2.4.7 质粒DNA的小量制备
• 2.2.4.8 序列测定与分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 ASPV的生物学鉴定及分子检测结果
• 2.3.1.1 生物学特性
• 2.3.1.2 TC-RT-PCR检测结果
• 2.3.2 病毒粒子形态观察
• 2.3.3 CP基因部分序列的克隆与序列分析
• 2.3.3.1 克隆与鉴定
• 2.3.3.2 核苷酸序列分析
• 2.3.4 小结与讨论
• 第三章 ASPV CP基因原核表达载体构建及表达蛋白抗体制备
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 CP基因来源及克隆所用质粒和菌株
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 引物设计
• 3.2 研究方法
• 3.2.1 CP基因克隆与序列测定
• 3.2.1.1 CP基因的PCR扩增
• 3.2.1.2 CP基因PCR产物的克隆
• 3.2.1.3 质粒DNA的制备及重组质粒的鉴定
• 3.2.1.4 序列测定与分析
• 3.2.2 CP基因的原核表达
• 3.2.2.1 原核表达载体的构建
• 3.2.2.2 CP基因在大肠杆菌中的诱导表达
• 3.2.2.3 SDS-PAGE分析
• 3.2.3 重组蛋白的大量制备及定量
• 3.2.4 抗血清的制备
• 3.2.4.1 免疫注射
• 3.2.4.2 抗血清的收集与保存
• 3.2.4.3 吸附去除非目的蛋白产生的抗体
• 3.2.5 间接ELISA（Indirect ELISA,ID-ELISA）测定抗血清的效价
• 3.2.6 Western-blot分析
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 基因克隆与序列测定
• 3.3.1.1 CP基因的扩增
• 3.3.1.2 重组克隆质粒的PCR及质粒酶切鉴定
• 3.3.1.3 CP基因序列分析
• 3.3.2 原核表达及抗血清制备
• 3.3.2.1 表达载体的构建
• 3.3.2.2 重组质粒转化表达菌BL21（DE3）
• 3.3.2.3 原核表达及SDS-PAGE分析
• 3.3.2.4 表达蛋白的Western-blot分析
• 3.3.2.5 重组蛋白的浓度测定
• 3.3.4 ID-ELISA法测定抗血清的效价
• 3.3.5 制备抗血清的Western-blot分析
• 3.3.6 小结与讨论
• 参考文献
• 附录:主要试剂及溶液的配制
• 致谢