论文摘要
背景慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B, CHB）是影响人类健康的严重疾病。核苷类药物已成为抗乙型肝炎病毒（HBV）治疗的重要药物,但随着用药时间的延长,病毒的耐药问题越来越严重。病毒耐药的基因突变主要集中在HBV P基因区,其中逆转录功能区C区的YMDD变异问题依然严峻。HBV通常复制活跃,且病毒聚合酶逆转录功能区不具备校正功能,因此易产生自然突变;近年来在未经拉米夫定治疗的慢性乙肝患者体内已检测到YMDD自然变异株的存在。自然变异毒株的比例可能是决定药物能否应用以及可用多长时间的重要因素,因此,在药物治疗前明确YMDD变异情况,对评估疾病的发展及药物的选择都具有重要意义。近年来出现了多种YMDD变异检测技术,各有自身的特点及适用范围。确定一种具有较高特异性及灵敏性且操作简便的方法对于临床检测的开展将具有重要意义。本研究分为两部分:①HBV DNA YMDD、YVDD和YIDD标准质粒的构建及三种常用HBV YMDD变异检测方法的评估;②未经抗病毒治疗的慢乙肝患者HBV YMDD自然变异株的流行病学研究。第一部分HBV DNA YMDD、YVDD和YIDD标准质粒的构建及三种常用HBV YMDD变异检测方法的比较目的构建HBV DNA YMDD、YVDD和YIDD三种质粒,为评估YMDD变异检测方法提供标准品;对目前临床应用较为广泛的三种YMDD变异株检测方法进行评估,确定一种操作简便、易于临床开展的YMDD变异株检测方法。方法PCR扩增HBV DNA包含YMDD的P基因片段,通过T/A克隆法构建重组质粒并加以鉴定,通过紫外分光光度计及荧光定量PCR对标准质粒进行定量。以不同比例混合的质粒样本、LAM治疗过程中出现表型耐药及部分未经抗病毒的慢性乙型肝炎患者血清为研究对象,通过对混合质粒的直接测序、探针特异性实时荧光PCR技术灵敏度、特异性的检验及引物特异性实时荧光PCR技术特异性及相对定量的验证,比较三种常用突变检测技术对变异株的检出能力。结果获得YMDD、YVDD及YIDD三种质粒,通过测序鉴定明确插入片段的序列与预期一致。不同比例（YIDD和YVDD标准质粒）混合的质粒的测序结果:对于YIDD或YVDD质粒占总质粒25%以下时,直接测序法不易检出。单探针（野生型探针）特异性实时荧光PCR技术灵敏度的检验:当野生型模板与突变模板的比例为1:5时,因为Ct值为33.11,此时还不能得出该样品为变异型（根据判断标准）,但实际上该混合模板中的突变模板已约占5/6;当野生型模板与突变模板的比例为1:10时,Ct值>40,可以判断该样品为HBV DNA YMDD变异型,此时该混合模板中的突变模板已约占10/11。显示该检测易造成假阴性。双探针（野生型及突变型探针）特异性实时荧光PCR技术表明,当野生型模板与突变模板的比例为10:1时,由扩增曲线得出野生模板与突变模板比例约为50:1,与实际比例不符。在引物特异性实时荧光PCR技术特异性的检验过程中,当突变株占总毒株的比例高于1/11时,该技术的特异性比较高,非特异性扩增不影响实际检测结果。在验证引物特异性实时荧光PCR技术相对定量中,随着变异株在总毒株中的比例逐渐降低,△Ct值也逐渐增大,YIDD毒株在总病毒量中的比例是1/11时,△Cti-c值为3.67,当YVDD毒株在总病毒量中的比例是1/11时,△Ctv-c值为3.48。临床验证中显示,105例拉米夫定表型耐药者,直接测序法检出97例YMDD变异（92.38%）,引物特异性实时荧光PCR检出95例YMDD变异（90.48%）,20例样本用单探针（野生型探针）特异性实时荧光PCR法检出9例YMDD变异（45.00%）;110例未经抗病毒者,直接测序法检出1例YMDD变异（0.91%）,引物特异性实时荧光PCR检出11例YMDD变异（10.00%）,20例样本用单探针（野生型探针）特异性实时荧光PCR法未检出YMDD变异。结论PCR产物直接测序法、探针特异性荧光PCR技术以及引物特异性实时荧光PCR技术均可用于YMDD变异的检测。直接测序法能够检测出优势模板,但当某模板占总模板的低于一定比例（约25%）时,难以对是否混合该模板以准确判定;探针特异性荧光PCR技术能够检测出优势模板,单探针技术（野生型探针）易造成假阴性,同时PCR竞争抑制及探针的非特异性结合会影响变异株检出的准确性;引物特异性荧光PCR法避免了竞争抑制的影响,当突变株占总毒株的比例高于1/11时,具有很好的特异性,通过确定合理的△Ct标准值,可判定是否存在突变株,同时可根据检测中的实际△Ct值对突变株进行相对定量。第二部分未经抗病毒治疗的慢乙肝患者HBV YMDD自然变异株的流行病学研究目的了解YMDD自然变异的发生情况及影响YMDD自然变异的因素。方法收集196例从未使用过抗病毒治疗的慢性乙肝患者的血清,采用引物特异性实时荧光PCR方法检测YMDD变异;分析性别、年龄、病毒载量、e抗原状态、疾病状态、病程、HBV基因型,通过t检验、卡方检验、Fish’s检验及Logistic回归分析,判断影响YMDD自然变异检出率的因素。结果在196例未采用抗病毒治疗的慢性乙肝患者中,检出21例YMDD自然变异者（10.70%）,其中YIDD阳性者1例,YVDD阳性者20例;变异毒株占总毒株超过50%者1例, 25%至50%者5例,9%至25%者15例。在196例CHB患者中,有182例进行了HBV基因分型,其中B基因型60例（30.61%）,C基因型122例（62.24%）。单因素分析:B基因型病例中,YMDD变异毒株的检出率（20.00%, 12/60）显著高于C基因型者（7.38%,9/122）,P=0.0122。多因素分析:仅HBV基因型进入回归模型,患者性别、年龄、HBeAg状态、HBV DNA载量、疾病状态未进入回归模型。结论在CHB患者中存在YMDD自然变异毒株;YMDD自然变异的发生率与患者性别、年龄、HBeAg状态、HBV DNA载量、疾病状态、病程无显著关系,B基因型病例比C基因型病例更易检测出YMDD自然变异株。