“睡美人”转座子系统对于外源基因整合和表达促进作用

论文摘要

“睡美人”（Sleeping Beauty , SB）转座系统属于Tc1/mariner转座子家族,已失活了一千多万年。1997年Ivics等根据积累的系统发生数据,利用生物信息学的方法进行分子重建,终于使其恢复转座活性。近年来对“睡美人”转座系统转座效率和转座机理的研究表明SB转座子系统在转基因,基因筛选,促进外源基因表达及基因治疗等领域具有广阔的应用前景。本研究利用“睡美人”转座子系统,比较睾丸直接注射法和SB系统介导下睾丸注射法转基因小鼠的制备效率,并分析了SB系统中的转座酶基因对基因免疫的增强作用。首先从本实验室已构建的精囊腺组织特异性表达载体（PC-EGFP）切出8.4kb含有EGFP的cDNA及其5’和3’调控序列表达片段,插入到“睡美人”转座子载体PT2-HB中获得PT2-EGFP。随后对睾丸直接注射制备转基因小鼠方法进行初步优化,利用已构建的SB系统和经过双酶切PC-EGFP获得的8.4kbDNA片段分别进行睾丸注射制备转基因动物,利用PCR方法比较转基因动物的制备效率,并对“睡美人”转座子与转座酶的比例进行了初步的摸索。研究结果表明,用4号针头,进行3次注射的公鼠与野生型ICR母鼠合笼后代的产子数及转基因阳性率较理想;经PCR并结合精囊腺和阴道栓的表达检测,SB系统介导的转基因阳性率（43%左右）显著高于普通8.4kb DNA片段的注射组（20%左右）,“睡美人”转座子与转座酶的比例在5:1-20:1范围,后代的阳性率差异不显著。本试验同时构建了表达人乳铁蛋白（human lactoferrin,hLF）的真核表达载体pA-hLF,在进行家兔人乳铁蛋白多抗的制备过程中,按照“睡美人”转座酶:PA-LF=4:1的比例用PEI包裹后注射新西兰家兔,并设置PA-LF与PEI包裹,裸露的PA-LF两个注射组与对照组,以评价“睡美人”转座酶对于外源基因表达的促进作用。结果表明:“睡美人”转座酶与PA-LF注射组其抗体效价可达1:6400,高于PEI包裹PA-LF组（1:1600）和裸露质粒注射组（1:2000）。研究结果表明“睡美人”转座酶对基因免疫具有促进作用,可作为一种新型基因佐剂在抗体制备过程中发挥一定的作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一篇 综述部分
• 综述一：“睡美人”转座子的研究进展
• 1 转座子与“睡美人”转座子的复苏
• 2 SB 转座系统的结构
• 2.1 转座酶基因
• 2.2 “睡美人”转座子
• 3 转座的机制
• 4 SB 转座子系统特性
• 4.1 转座效率的影响因素
• 4.2 安全性
• 5 SB 转座子系统的检测
• 6 SB 转座子系统的应用
• 6.1 用做作转基因载体
• 6.2 促进外源基因表达
• 6.3 基因治疗
• 6.4 新基因的发现
• 综述二 转基因动物的研究进展
• 1 转基因的主要技术
• 1.1 原核注射法
• 1.2 逆转录病毒感染法
• 1.3 胚胎干细胞介导法
• 1.4 电转移法
• 1.5 人工酵母染色体（YAC） 法
• 1.6 体细胞核移植转基因法
• 1.7 精子载体法
• 2 存在问题
• 综述三 基因免疫的研究进展
• 1 基因疫苗的发展概况
• 2 基因疫苗的免疫学机理
• 3 基因疫苗的免疫佐剂
• 3.1 免疫刺激DNA 序列
• 3.2 细胞因子的免疫佐剂效应
• 3.3 趋化因子和共刺激分子基因作为DNA 疫苗免疫调节剂
• 3.4 基因佐剂联合应用作为DNA 疫苗免疫调节剂
• 第二篇 实验部分
• 第一章 “睡美人”转座子载体的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 2 试验方法
• 2.1 人乳铁蛋白克隆载体PSPⅡ-EGFP 的复苏
• 2.2 碱性裂解法小规模提取质粒
• 2.3 质粒PSPⅡ-EGFP 的Nru Ⅰ/Xho IⅠ酶切鉴定
• 2-HB'>2.4 EcoRV 酶切质粒PT₂-HB
• 2.5 酶切产物的纯化
• 2.6 质粒PSPⅡ-EGFP 的NruⅠ/XhoI Ⅰ酶切，补平及纯化
• 2-HB 之间的平端连接及转化'>2.7 5’UTR-EGFP-3’UTR 与PT₂-HB 之间的平端连接及转化
• 2.8 目的质粒的鉴定
• 3 结果
• 3.1 质粒PSPⅡ-EGFP 的Nru Ⅰ/Xho IⅠ酶切鉴定
• 2-EGFP 及PSPⅡ-EGFP 质粒的酶切验证'>3.2 PT₂-EGFP 及PSPⅡ-EGFP 质粒的酶切验证
• 2-EGFP 的5’PCR 验证结果'>3.3 质粒PT₂-EGFP 的5’PCR 验证结果
• 2-EGFP 的GFP 验证结果'>3.4 质粒PT₂-EGFP 的GFP 验证结果
• 2-EGFP 的3’PCR 验证结果'>3.5 质粒PT₂-EGFP 的3’PCR 验证结果
• 4 讨论
• 第二章 睾丸注射法制备转基因动物方法的初步优化
• 1 材料
• 2 试验方法
• 2.1 质粒的准备
• 2.2 外源DNA-PEI 混合物的制备
• 2.3 睾丸内DNA-PEI 混合物的注射
• 2.4 转基因小鼠的PCR 鉴定
• 2.5 对于睾丸注射法制备转基因小鼠方法的优化
• 3 结果
• 3.1 转基因小鼠的PCR 检测
• 3.2 睾丸注射法制备转基因小鼠方法的优化
• 4 讨论
• 第三章 “睡美人”转座子系统介导与普通睾丸直接注射法制备转基因动物的效率比较
• 1 材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 主要试验仪器
• 1.3 主要实验试剂
• 2 试验方法
• 2.1 质粒的准备
• 2.2 外源DNA-PEI 混合物的制备
• 2.3 睾丸内DNA-PEI 混合物的注射
• 2.4 转基因小鼠的表达鉴定
• 3 结果与讨论
• 3.1 “睡美人”转座子系统对于外源基因整合的促进作用
• 3.2 转基因小鼠的表达鉴定
• 4 讨论
• 第四章 “睡美人”转座酶对基因免疫的促进作用
• 1 材料与方法
• 1.1 材料与试剂
• 1.2 hLFcDNA 的克隆及真核表达载体的构建
• 1.3 基因免疫
• 1.4 间接ELISA 法血清效价的测定
• 1.5 用自制抗体进行的Western-blotting 检测
• 2 结果
• 2.1 hLF 基因的真核表达载体构建
• 2.2 基因免疫抗体的效价
• 2.3 自制抗体的初步应用
• 3 讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位论文期间发表学术论文