论文摘要
研究背景和目的:脓毒症具有较高的死亡率,严重危害人类健康。目前研究表明:脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）激活单核/巨噬细胞引起的细胞因子过度释放是临床上脓毒症的主要原因之一。LPS进入体内后主要是通过与脂多糖结合蛋白（LPS-binding protein, LBP）结合转运到细胞膜上,与分泌型蛋白MD-2、膜上的CD14、TLR4（Toll-like receptor 4）等分子结合,形成结合有LPS的受体复合体,由TLR4胞内段与MyD88结合启动LPS信号转导通路,最终引起NF-κB的活化,引起促炎症细胞因子的释放,使得炎症反应放大。髓样细胞表达的触发受体-1（triggering receptors expressed on myeloid cells-1,TREM-1）是新近发现的能放大炎症反应的又一重要分子,对LPS等细菌产物引发的急性炎症发应有显著放大作用,该分子被认为可能是拮抗脓毒症的重要靶分子之一。TREM-1分子选择性表达于中性粒细胞、CD14+单核/巨噬细胞表面,分子表面有三个抗体等效互补决定区（antibody-equivalent complementarity determining region, CDR）。该分子在体内有两种存在方式:膜结合型和可溶型,可溶型的TREM-1相当于膜结合型的胞外区。膜结合型TREM-1的活化需要LPS和位于血小板上的未知配体协同作用,活化后能显著上调促炎症细胞因子（TNF-α、IL-6、IL-1β、GM-CSF）和趋化因子（IL-8、MCP-1）的持续分泌及髓过氧化物酶（myeloperoxidase, MPO）的释放,引起中性粒细胞脱颗粒、呼吸暴发和吞噬反应,并抑制抗炎因子IL-10的表达;而可溶型TREM-1的功能则是抑制促炎症细胞因子的产生,对败血症动物模型有保护作用。TREM-1分子的氨基酸的保守性分析发现CDR1附近的氨基酸序列也较为保守,而该区域的功能目前还无报道,该区域是否参加了TREM-1分子与LPS或天然配体的作用目前尚不明确。因此本研究拟通过原核表达得到小鼠TREM-1CDR1保守区融合蛋白,并进行纯化及相应的初步鉴定,为研究该区域的功能奠定基础。主要技术方法:从正常成年昆明小鼠组织中提取细胞基因组DNA,利用PCR技术扩增出小鼠TREM-1分子CDR1保守区基因片段。构建好PET-30a（+）-CDR1原核表达载体,并转化到BL21（DE3）plysS大肠杆菌中通过IPTG诱导表达。表达产物进行Tricine-SDS-PAGE电泳分析和Western blot检测分析鉴定。超声碎菌法对目的融合蛋白进行分离,并进行亲和层析纯化,最后经过透析复性获得目的融合蛋白。结果:1.通过对小鼠TREM-1的同源性分析发现,CDR1附近较保守的氨基酸残基主要位于羧基端的第31-56位,由DNAMAN软件比对该区域的DNA和cDNA序列,发现其位于同一外显子,故以小鼠基因组DNA为模板,确定扩增编码18-63位的氨基酸的核苷酸序列。2.采用PCR技术,以小鼠基因组DNA为模板,扩增得到了编码小鼠TREM-1含CDR1的保守区的长176bp的基因序列,其中含限制性酶切位点、原核终止密码子等。3.将该基因序列与原核表达载体pET30a（+）双酶切后,连接产物转化DH5α大肠杆菌,小量提取质粒,序列测定结果表明成功构建了pET-30a（+）-CDR1表达载体。4.构建好的质粒成功转化表达菌BL21（DE3） plysS,通过IPTG诱导阳性菌株进行表达,并优化表达条件,.确定了最适宜的表达条件为30°C减慢诱导7h。电泳结果表明,重组阳性菌诱导后表达出约12kD大小的新生融合蛋白带,与预期融合蛋白分子量相符。Western blot鉴定结果显示该蛋白与小鼠anti-His单克隆抗体有特异性结合能力。5.应用Qiagen公司的Ni-NTA agarose,经pH梯度洗脱进行含6×His标签融合蛋白的亲和层析纯化。经含GSH/GSSH的透析液透析复性,获得小鼠TREM-1含CDR1的保守区融合蛋白。结论:1.成功构建小鼠TREM-1含CDR1保守区基因的原核表达载体,并在BL21（DE3） plysS大肠杆菌中稳定大量表达;2.率先研究发现:含小鼠TREM-1 CDR1保守区的目的融合蛋白主要以可溶性蛋白形式表达,并说明通过原核表达获得含该区域的融合蛋白是可行的。3.经Ni-NTA agarose亲和层析纯化,获得小鼠TREM-1含CDR1保守区的融合蛋白,为研究小鼠TREM-1含CDR1保守区的功能奠定了基础。
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