论文摘要
间充质干细胞（MSC）是最先从骨髓中分离出来的一群具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞。近年来许多学者在骨髓以外的组织器官中也分离出MSC,包括肌肉、脂肪、骨实质、胰腺、胸腺、肺脏、脐带和胎盘等几乎机体所有的组织和器官。MSC在特定的诱导条件下能够向骨、软骨、脂肪、肌肉等多种间充质系统细胞分化;体外和体内实验均证明了MSC及其分化细胞可给予造血细胞结构和功能上的支持,具有造血支持作用。MSC具有的这些功能使之成为了组织工程和骨髓移植细胞治疗的研究热点。造血干细胞移植是一些难治性血液病（白血病、再障、免疫缺损病、极重度放射病等）最有效且唯一的解决途径。急性移植物抗宿主病（aGvHD）是异体造血干细胞移植（allo-HSCT）常见的并发症和死亡原因。近年来,MSC强大的免疫调节功能逐渐受到人们的重视,这促使了MSC进入临床应用于aGvHD的治疗。目前,疗效良好,在美国已进入Ⅲ期临床。但由于小鼠MSC分离和培养困难的瓶颈,限制了MSC用于常用的小鼠模型进行体内免疫调节功能机制的研究。本研究的主要目的是探讨小鼠骨实质MSC的生物学特性及其抑制aGvHD的机制。具体研究内容包括建立一种新的小鼠MSC分离培养的方法—胶原酶消化后的骨实质分离小鼠MSC,并对细胞的一般形态、免疫表型、分化能力、支持造血和免疫调节功能进行鉴定;建立小鼠aGvHD模型,给予模型小鼠尾静脉共输注MSC,观察输注后小鼠平均生存时间,病理变化确定MSC抑制aGvHD的效果,并在此基础上对MSC抑制aGvHD的体内机制作进一步探讨。本实验中,采用了骨片消化法分离培养小鼠MSC。培养中,纤维样的细胞从骨片周围爬出,渐渐长满瓶皿;这些细胞有较均一的表型,是一群非造血（CD45-）,非巨噬（CD11b-）,非内皮（CD31-）,仅表达一些细胞粘附分子（CD29+、CD44+、CD105+）的干细胞（Sca-1+）群体,经传代后能够保持较稳定的细胞表型;具有较稳定的克隆形成能力;经诱导能够向脂肪、成骨、软骨细胞分化。进一步对这种方法培养的细胞进行功能检测,结果表明:它们体外具有与骨髓基质细胞相似的造血支持功能和抑制ConA或异种细胞刺激的淋巴细胞增殖的能力。MSC输注可延长异种皮肤移植的平均生存时间,说明此种小鼠骨实质来源的MSC具有体内免疫调节能力。aGvHD发生的病理生理过程可划分为三个阶段。阶段Ⅰ:预处理作用,在移植之前的放化疗作用造成机体上皮和内皮的损伤,使抗原呈递细胞（APC）活化成熟;阶段Ⅱ:供者T细胞接受APC呈递的抗原,活化,增殖;阶段Ⅲ:炎性因子和细胞杀伤作用损伤靶器官。机体的损伤可进一步活化APC,使疾病进入一个渐进的恶性循环,所以,aGvHD一旦发生,就很难控制。应用异种脾细胞尾静脉输注建立小鼠aGvHD模型,发现MSC共输注延长了aGvHD小鼠的平均生存时间,并呈剂量依赖关系;改善了aGvHD小鼠靶器官的病理改变。进一步的对脾细胞表型及功能的检测表明:MSC输注降低了aGvHD小鼠脾脏CD11b+细胞MHCⅡ和早期活化分子CD69的表达;降低了CD3+细胞早期活化分子CD69的表达和脾细胞的增殖;降低了脾细胞的杀伤功能。MSC提高了脾脏CD4+细胞的比例,晚期降低了CD8+细胞的比例,从而明显提高了CD4+/CD8+的比值;CD4+CD25+调节性T细胞（Tregs）活化后表达FoxP3,临床观察,aGvHD患者单独Tregs数量与疾病严重程度无相关性,原因在于aGvHD患者存在着Tregs的数量严重减少和T淋巴细胞的大量增殖。Tregs的靶细胞是CD8+T淋巴细胞,患者的外周血和靶器官FoxP3+/CD8+的比值与疾病严重程度有密切的相关性。我们的实验结果与此相互验证:MSC仅略微提高了Tregs的比例,但Tregs/CD8+的比值却被显著提高。aGvHD的发生发展有三个必要条件,是在1966年界定的Billingham三原则:1.宿主必须处于免疫抑制或缺陷状态;2.移植物中含有免疫功能的细胞;3.宿主和供者之间存在着不相容性抗原。在1989年提出,并在1993年确定并加入的第四条原则:效应细胞必须能迁移到aGvHD靶器官,称为Billingham的修订原则,此修订原则强调了效应细胞迁移到aGvHD靶器官的重要性。令我们感兴趣的是:MSC输注增加了aGvHD小鼠二级淋巴器官（SLO）的T淋巴细胞的数量。表达CD62L和CCR7分子是T淋巴细胞进入SLO的先决条件。体外的混合淋巴细胞反应中,MSC的存在,使T细胞（包括Tregs）保持了幼稚细胞的表型（CD62L+/CCR7+）,并且保持了这些细胞的由二级淋巴组织趋化因子（SLC）引导的细胞迁移。树突状细胞（DC）是体内免疫反应的启动者,表达CCR7对DC的成熟并进一步向SLO迁移至关重要。在体外DC诱导过程中,MSC的存在降低了DC的CD80、CD86、CD40、CDIab的表达并明显降低了CCR7的表达,并且这种DC向SLC的迁移作用也相应的减弱。以上过程主要是通过MSC分泌的可溶性分子来实现的。T细胞活化和DC的迁移功能的发挥总是与细胞骨架重排相伴行的。MSC共培养减少了T细胞极化和伪足的形成,减少了DC的极化和树突的形成,降低其相关信号通路蛋白Racl和Cdc42的活化可能使其原因。相一致地,MSC输注使aGvHD小鼠SLO中T细胞保持了幼稚（CD62L+/CCR7+）的表型,并且降低了SLO中DC的比例和CCR7的表达。用转入eGFP的MSC输注来示踪输注后MSC的体内分布,发现MSC主要分布于外周组织和器官,而极少进入SLO,MSC极少表达CD62L和CCR7可能是这一现象的原因。综上所述,此种简单易行方法所培养的小鼠骨实质MSC,符合MSC的特征,具有MSC功能,可进一步用于小鼠生理和病理模型的研究;MSC从aGvHD发-生的三个阶段均能抑制其发展,改变T淋巴细胞亚群的比例可能是MSC体内发挥免疫调节的机制之一;通过改变T和DC的迁移功能对MSC抑制aGvHD起到了重要作用。本研究的创新点:1.应用一种新方法培养小鼠MSC,突破了小鼠MSC培养困难的瓶颈;2.将MSC应用于小鼠aGvHD模型,进行MSC体内免疫调节功能的机制探讨;3.发现MSC在体外,体内均能改变T细胞和DC的迁移功能,此改变是MSC抑制aGvHD的机制之一。此研究对MSC移植发挥体内免疫调节的机制提供了新线索,为MSC更好地应用于临床治疗奠定基础。
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标签：间充质干细胞论文; 急性移植物抗宿主病论文; 淋巴细胞论文; 树突状细胞论文; 迁移论文;