论文摘要
第一章氧糖剥夺再灌注后Hsp20的表达变化目的：探讨氧糖剥夺再灌注后细胞活力、细胞凋亡及Hsp20的表达变化,并观察氧糖剥夺再灌注后线粒体、高尔基体等细胞结构的变化,为下一步研究Hsp20的神经保护作用及其机制奠定基础。方法：小鼠脑神经瘤N2a细胞经氧糖剥夺再灌注后,采用MTT法检测细胞活力,流式细胞技术检测细胞凋亡率的变化；并采用免疫荧光技术研究高尔基体、线粒体等细胞结构的变化,采用Western blot及实时定量PCR检测Hsp20与高尔基体蛋白GM130的蛋白基因表达变化。结果：1.氧糖剥夺4小时并再灌注12及24小时后,N2a细胞的活力明显下降（P<0.01）。同时,氧糖剥夺4小时并再灌注6、12及24小时后,N2a细胞的凋亡率明显增高（P<0.05）。2.氧糖剥夺4小时并再灌注0小时及6小时后,Hsp20的蛋白及基因表达水平与基础水平比较明显下降（P<0.05）。再灌注12小时及24小时后,则回到基础水平。3.氧糖剥夺4小时并再灌注0小时及6小时后,丝氨酸磷酸化Hsp20蛋白与总Hsp20蛋白的比值,与基础水平比无显著性差异。再灌注12小时及24小时后,其比值则比基础水平明显增高（P<0.05）。4.氧糖剥夺再灌注后,高尔基体蛋白GM130的蛋白及基因表达、高尔基体形态均未见明显变化,而线粒体则发生了碎裂,相互间紧密连接消失。结论：氧糖剥夺再灌注后,N2a细胞的活力明显受损,凋亡率增高,Hsp20及磷酸化Hsp20的表达受氧糖剥夺再灌注的调节,同时线粒体发生了碎裂,但高尔基体形态及GM130的表达并未发现明显变化。第二章Hsp20野生型及其突变体的构建和表达目的：构建Hsp20野生型、Ser16磷酸化突变体Hsp20s16D及Ser16去磷酸化突变体Hsp20s16A的表达质粒,为进一步研究Hsp20的神经保护作用及其机制做好前期准备工作。方法：使用小鼠脑神经瘤N2a细胞抽提RNA,逆转录成cDNA后,利用特异性Hsp20引物和带突变位点的长引物进行PCR,以获得Hsp20的CDS序列,将带有酶切位点的PCR产物,连接到1pEGFP-N1表达载体中,经过酶切鉴定和测序证实其正确性。将构建好的载体转染到N2a细胞中,通过免疫荧光和免疫印迹,观察Hsp20野生型、Ser16磷酸化突变体Hsp20s16D及Ser16去磷酸化突变体Hsp20s16A表达质粒在细胞中的表达。结果：通过PCR法成功获得小鼠Hsp20 CDS序列,并成功连接到pEGFP-N1表达载体中,经测序和酶切鉴定正确。免疫荧光证实Hsp20野生型、Ser16磷酸化突变体Hsp20S16D及Ser16去磷酸化突变体Hsp20S16A表达分布相同,免疫印迹显示构建的Hsp20野生型和突变体能成功表达且分子量大小正确。结论：成功构建了Hsp20野生型、Ser16磷酸化突变体Hsp20s16D及Ser16去磷酸化突变体Hsp20s16A的表达质粒,为下一步研究Hsp20的神经保护作用及其机制奠定了基础。第三章Hsp20的神经保护作用及其机制目的：研究氧糖剥夺再灌注后Hsp20的神经保护作用并探讨其可能机制。方法：将构建成功的Hsp20野生型、Ser16磷酸化突变体Hsp20S16D及Serl6去磷酸化突变体Hsp20S16A的表达质粒转染小鼠脑神经瘤N2a细胞,各组细胞经历氧糖剥夺再灌注后,采用MTT法、流式细胞技术及免疫荧光技术,检测细胞活力、凋亡率及线粒体的变化,并采用Western blot技术检测Bax, Bcl-2及细胞色素C的释放变化,探讨Hsp20在保护神经细胞线粒体凋亡通路中的作用。结果：1.转染Hsp20野生型及Ser16磷酸化突变体Hsp20s16D的细胞经氧糖剥夺4小时并再灌注12及24小时后,与空载体相比,细胞活力增高（P<0.05）,细胞凋亡率下降（P<0.01）2.转染Ser16去磷酸化突变体Hsp20s16A的细胞,经氧糖剥夺再灌注后,其细胞活力及细胞凋亡率与空载体组相比没有显著性差异。3.转染Hsp20野生型及Ser16磷酸化突变体Hsp20s16D的细胞经氧糖剥夺再灌注后,线粒体的碎裂程度明显降低,而转染Serl6去磷酸化突变体Hsp20s16A的细胞,其细胞内线粒体碎裂程度较空载体组则并未见明显区别。4.转染Hsp20野生型及Serl6磷酸化突变体Hsp20s16D的细胞经氧糖剥夺再灌注后,Bcl-2的表达水平增高,Bax的表达水平下降,从线粒体释放到胞浆中的细胞色素C减少（P<0.05）,而转染Ser16去磷酸化突变体Hsp20S16A细胞中Bax,Bcl-2及细胞色素C的表达,与空载体组相比则没有显著性差异。结论：1.Hsp20在氧糖剥夺再灌注中具有神经保护作用。2. Hsp20在氧糖剥夺再灌注中的神经保护作用与Serl6磷酸化有关,阻断Ser16磷酸化则其不再具有神经保护作用。3. Hsp20的神经保护作用与保护线粒体结构稳定有关。4. Hsp20的神经保护作用与抑制线粒体凋亡通路有关。
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