猪肺炎支原体伴侣蛋白DnaK单克隆抗体的制备及鉴定

论文摘要

猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp）是猪地方性肺炎（swine Enzootic Pneumnoia,SEP）的病原体。SEP亦称猪气喘病（Mycoplasma Pneumoniae of swine,MPS）,广泛分布于世界各地,以接触性、高度传染性、慢性、高发病率和低死亡率为特点。由于Mhp能够破坏呼吸道黏膜-纤毛屏障而继发其他致病菌的感染,使死亡率大大提高,给养猪业造成巨大的经济损失。由于早期检测的困难和缺乏有效的药物,在疾病控制方面至今未能达到满意的效果。伴侣蛋白Dnak是猪Mhp的特异性外膜蛋白,该蛋白C端的是其主要的抗原决定簇。本研究依据GenBank中公布的Yin-1基因序列,以猪Mhp中国分离株Yin-1为模板,利用所合成的特异性引物,扩增DnaK基因的C末端,得到1 000bp的目的片段。将该序列克隆到pMD-18-T载体上,经PCR、酶切方法鉴定正确后测序,测序结果与GenBank公布的Yin-1标准株的DNA比较,二者同源性达99%以上。并将测序结果正确的片段分别克隆至表达载体pET-28a和pGEX-6P-1中,转化到大肠杆菌（DE3）中进行原核表达。将所获得的重组蛋白分别命名为6P-1-DnakC和28a-DnakC。经超声裂解,进行SDS-PAGE分析,表明重组蛋白均主要以可溶形式存在于上清液中,在42kD和65kD处分别获得特异性条带。Western-blot抗原性分析结果表明二者均具有较好的免疫原性。利用Histag亲和层析柱,对重组蛋白28a-DnakC进行分离纯化,纯化产物经SDS-PAGE电泳分析,结果显示为单一蛋白条带,纯化效果较好。以6P-1-DnakC作为免疫抗原分别与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂乳化,免疫8周龄的雌性BALB/C小鼠,每只每次500μg,间隔两周免疫一次,最后一次加强免疫不加佐剂,5d后取免疫小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。以纯化28a-DnakC作为包被抗原,用间接ELISA平行筛选阳性克隆,经有限稀释法三次亚克隆后,获得两株能稳定分泌特定性抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1AD10和2AF11。生物学特性鉴定表明,腹水单抗1AD10、2AF11的间接ELISA效价分别为1:105和1:104,亚型鉴定分别为IgG2b和IgG2a亚类,且轻链均为k链。相加ELISA试验表明,两株单抗识别不同的抗原表位。经Western-blot分析表明,两株单抗特异性的针对猪肺支原体Yin-1株65KD和42KD左右的抗原成分。而与其他相关支原体,如丝状支原体丝状亚种SC型标准株（PGI）、丝状支原体丝状亚种LC型标准株（Y-goat）、山羊支原体山羊肺炎亚种（Mccp）、猪鼻支原体（Mh）无交叉反应,表明两株单抗为针对猪肺炎支原体的特异性单抗。本试验获得的抗Dnak单抗将为更深入地分析Mhp的结构、功能及生物学诊断提供有力工具。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 猪肺炎支原体基本特性
• 1.2 猪气喘病血清学
• 1.3 猪肺炎支原体的黏附因子P97
• 1.4 猪肺炎支原体主要免疫原蛋白
• 1.4.1 热休克蛋白
• 1.4.2 其他膜蛋白
• 1.5 诊断方法研究现状
• 1.5.1 临床诊断
• 1.5.2 血清学抗体检测
• 1.5.3 病原学诊断检测
• 1.5.4 核酸探针检测
• 1.5.5 聚合酶链式反应（PCR）
• 1.6 Mhp 疫苗
• 1.6.1 国内常规疫苗概况
• 1.6.2 基因工程疫苗
• 1.7 抗猪肺支原体主要免疫原蛋白单克隆抗体的研究进展
• 1.7.1 抗P36 蛋白单抗
• 1.7.2 抗P46 蛋白单抗
• 1.7.3 抗P74 蛋白单抗
• 1.7.4 抗P97 蛋白单抗
• 1.7.5 抗P65 蛋白单抗
• 1.8 研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 毒株、菌株与质粒
• 2.1.2 动物与细胞
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要设备
• 2.1.5 主要溶液及其配制
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 目的基因的克隆连接与鉴定
• 2.2.2 融合蛋白的诱导表达、纯化及SDS-PAGE 电泳检测
• 2.2.3 6P-1-DnkC 及纯化蛋白28a-DnkC 免疫原性分析
• 2.2.4 BALB/C 小鼠免疫程序
• 2.2.5 筛选方法（间接ELISA）的建立
• 2.2.6 细胞融合
• 2.2.7 阳性杂交瘤细胞的筛选及克隆化
• 2.2.8 阳性杂交瘤细胞的冻存与复苏
• 2.2.9 单克隆抗体特性的鉴定
• 3 结果
• 3.1 目的基因的克隆连接与鉴定
• 3.1.1 PCR 扩增目的基因
• 3.1.2 pMD-18-TDnakc 质粒鉴定结果
• 3.1.3 pET-28a-Dnakc 和pGEX-6P-1-Dnakc 的双酶切鉴定结果
• 3.2 重组蛋白28a-DnakC、6P-1-DnakC SDS-PAGE 分析
• 3.2.1 重组蛋白28a-DnakC SDS-PAGE 分析
• 3.2.2 重组蛋白6P-1-DnakC SDS-PAGE 分析
• 3.3 重组蛋白28a-DnakC 的纯化及浓度测定
• 3.3.1 重组蛋白28a-DnakC 的纯化
• 3.3.2 重组蛋白pET-28aDnakC 浓度的测定
• 3.4 重组蛋白28a-DnakC 和6P-1-DnakC 免疫原性分析
• 3.5 蛋白pET-28aDnakC 包被ELISA 方法最佳工作条件的建立
• 3.6 动物抗体水平检测
• 3.7 融合细胞筛选
• 3.7.1 细胞融合率与阳性率的计算
• 3.7.2 单克隆抗体的筛选与单克隆杂交瘤细胞株的建立
• 3.7.3 抗Dnak 单克隆抗体细胞株的建立
• 3.8 抗体亚类鉴定结果
• 3.9 单克隆抗体特性的鉴定结果
• 3.9.1 单克隆抗体ELISA 效价
• 3.9.2 ELISA 检测两株单抗与重组蛋白28a-DnakC 的反应性
• 3.9.3 单抗的Western-blot 分析
• 3.9.4 单克隆抗体的稳定性及抗原表位分析
• 4 讨论
• 4.1 单抗抗原的选择
• 4.2 Dnak 基因C 端的选择
• 4.3 筛选系统的建立
• 4.4 单克隆抗体制备过程中的注意事项
• 4.4.1 免疫抗原
• 4.4.2 细胞融合
• 4.4.3 杂交瘤细胞的克隆化和冻存
• 4.4.4 单克隆抗体的生产和效价测定
• 4.5 单抗免疫原性结果的分析
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士期间发表的学术论文