低能离子诱变选育类球红细菌高产5-氨基乙酰丙酸菌株的研究

论文摘要

5-氨基乙酰丙酸（ALA）是一种无公害绿色的除草剂、光动力杀虫剂、抗微生物药剂、植物生长促进剂。类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides）生物合成ALA因简单、产率高,具有工业化潜力,倍受国内外研究者及产业界的关注。本研究以产5-氨基乙酰丙酸的野生型类球红细菌为出发菌,以20 keV氩离子对出发菌进行诱变,选育高产5-氨基乙酰丙酸菌株,并对突变株的培养条件进行优化,在此基础上,通过PCR技术和生物信息学方法分析出发菌株和突变菌株的hemA基因在分子水平上的序列差异。获得以下主要研究结果:1.选用能量20 keY氩离子,注入剂量为0.26×1015ions/cm2～2.47×1015ions/cm2对出发菌进行诱变,通过存活率和突变率分析,经过三轮诱变筛选,获得一株高产5-氨基乙酰丙酸突变株RB,其注入剂量为1.30×1015ions/cm2。2.经多次传代实验,结果表明:该菌株遗传稳定性较好。突变株RB的5-氨基乙酰丙酸产量为9.23mg/L,较出发菌株的产量（3.78 mg/L）明显提高,是出发菌株的2.44倍。3.对突变株RB的培养条件进行优化,结果表明:类球红细菌突变株RB的最适培养条件为pH 7.0,接种量10%,光照强度3000 lux。在此条件下RB菌株的ALA产量最高。4.根据原始序列设计引物,从突变株RB中扩增出了hemA基因,并对其进行了序列分析,发现突变体hemA基因有36处碱基发生改变,导致7个氨基酸发生变化。碱基突变以转换为主,转换频率为69.4%,颠换频率为30.6%。突变株hemA基因碱基和氨基酸序列的变异可能是突变株活性提高的原因,这为进一步分析ALA高产突变的分子机制奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 文献综述
• 1.1 5-氨基乙酰丙酸（ALA）研究进展
• 1.1.1 ALA简介
• 1.1.2 ALA生物合成的分子机制及调节途径
• 1.1.3 ALA的应用及前景展望
• 1.1.4 微生物发酵生产ALA
• 1.2 离子束生物工程学的发展概况
• 1.2.1 离子束生物工程学的兴起与发展
• 1.2.2 离子注入系统介绍
• 1.2.3 离子束注入技术在生物工程学上的应用
• 2 引言
• 2.1 研究的内容和目标
• 2.1.1 研究内容
• 2.1.2 研究目标
• 2.2 研究的技术路线
• 3 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌株
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 主要仪器设备和试剂
• 3.2 方法
• 3.2.1 类球红细菌的培养及ALA产量测定
• Y的低能离子束注入'>3.2.2 类球红细菌出发菌株R_Y的低能离子束注入
• B的筛选'>3.2.3 类球红细菌突变菌株R_B的筛选
• B的ALA产量影响因素'>3.2.4 类球红细菌突变菌株R_B的ALA产量影响因素
• 3.2.5 类球红细菌突变的分子水平研究
• 4 结果与分析
• 4.1 类球红细菌的培养及ALA产量测定
• 4.1.1 类球红细菌的培养条件
• 4.1.2 类球红细菌ALA产量测定
• B的筛选'>4.2 类球红细菌突变株R_B的筛选
• 4.2.1 存活率分析
• 4.2.2 突变率分析
• B的遗传稳定性检测'>4.2.3 类球红细菌突变菌株R_B的遗传稳定性检测
• B ALA产量分析'>4.3 类球红细菌突变株R_BALA产量分析
• B与原始菌株R_Y产ALA分析'>4.3.1 突变菌株R_B与原始菌株R_Y产ALA分析
• B产ALA的影响'>4.3.2 初始pH对类球红细菌突变株R_B产ALA的影响
• B产ALA的影响'>4.3.3 光照强度对类球红细菌突变株R_B产ALA的影响
• B产ALA的影响'>4.3.4 接种量对类球红细菌突变株R_B产ALA的影响
• 4.4 类球红细菌突变的分子水平研究
• 4.4.1 基因组DNA的提取
• 4.4.2 引物设计
• 4.4.3 基因的PCR扩增结果
• 4.4.4 重组子的鉴定
• 4.4.5 序列分析
• 5 讨论
• 5.1 类球红细菌的培养
• 5.2 离子注入剂量对类球红细菌存活率的影响
• 5.3 类球红细菌产ALA的影响因素探讨
• 5.4 类球红细菌的分子机制研究探讨
• 6 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 附录