足细胞内质网应激对钙神经蛋白表达的调控研究

论文摘要

背景在我国,糖尿病肾病（diabetic nephropathy, DN）是终末期肾病（end stage renal disease, ESRD）的第二大原因。其发病机制复杂,至今未得到全面的认识,也没有有效的治疗方法。钙神经蛋白（calcineurin, CaN）是一种钙离子敏感的蛋白磷酸激酶,能调节足细胞骨架蛋白synatopodin的稳定性。内质网应激是指细胞内质网未折叠或错误折叠蛋白堆积时引起的细胞应激反应。近来有研究提示在内质网应激（endoplasmic reticulum stress, ERS）时CaN活性增加。糖尿病（diabetes mellitus,DM）状态下体内棕榈酸盐升高,体外细胞试验证明棕榈酸盐能引起ERS。熊去氧胆酸（ursodeoxycholic acid, UDCA）是内质网应激的化学分子伴侣,体外大鼠肝细胞及糖尿病模型小鼠实验都证明UDCA能降低ERS感应蛋白PKR类似的内质网激酶（PKR-like ER kinase, PERK）和肌醇依赖酶1α （Inositol-requiring enzyme1α, IRE-la）的磷酸化,抑制ERS依赖的JNK凋亡途径,缓解ERS引起的损伤。足细胞是维持肾小球滤过屏障的主要成分,足细胞数量减少、足突消失是DN损伤时引起蛋白尿的重要原因。我们的前期工作发现早期DN中存在足细胞ERS,但ERS对足细胞CaN的调控尚无报道。进一步深入研究足细胞ERS对CaN的影响对糖尿病肾病甚至蛋白尿患者临床上是否以及怎样合理选择使用钙神经蛋白抑制剂（calcineurin inhibitor, CNI）具有指导意义,同时,也有助于进一步明晰CaN在蛋白尿发病机制中的作用。目的以体内、外试验方法,探讨糖尿病肾病状态下,足细胞内质网应激时钙神经蛋白的变化。方法以C57BLKS/JLepr db/db早期糖尿病肾病模型小鼠为研究对象,以db/m小鼠为对照,分6周龄、9周龄和12周龄3组,使用激光共聚焦法检测肾小球足细胞CaN的变化特点。另以棕榈酸盐或联用UDCA为刺激物,作用于永生小鼠足细胞系,观察其对足细胞CaN表达的影响。使用Real-Time PCR的方法观察不同棕榈酸盐浓度刺激下足细胞CaN mRNA水平的变化；使用激光共聚焦法和western blotting方法在蛋白水平检测棕榈酸盐或联用UDCA后足细胞CaN的变化；western blotting方法同时观察足细胞骨架蛋白synpatopodin的变化。结果（1）db/db糖尿病肾病模型小鼠肾小球足细胞CaN的表达随尿蛋白量的增加而升高,分布与synatopodin相似,足细胞synaptopodin的表达随蛋白量的增加而降低。（2）体外小鼠足细胞CaN的mRNA水平随棕榈酸盐刺激浓度由250μM增加到500gM而明显增加,高低浓度表达的差异具有统计学意义,p<0.05；激光共聚焦检测棕榈酸盐作用下足细胞CaN的表达上调,而加用UDCA后CaN的表达下降,p<0.05; western blotting法证明棕榈酸盐作用下足细胞CaN的表达上调,而加用UDCA后CaN的表达下降。结论（1） db/db糖尿病肾病模型小鼠足细胞中,随尿蛋白增加,足细胞骨架蛋白synaptopodin表达下降,ERS时存在CaN表达的升高。（2）体外研究发现,足细胞ERS时对CaN的表达有正向调节作用。

论文目录

• 英文缩略词
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 研究对象及方法
• 一、研究对象
• 二、实验仪器及耗材
• 三、主要试剂
• 四、实验溶液配制
• 1 0.01 M PBS
• 2 0.01 M胶原盐酸溶液
• 3 完全培养基
• 4 5mM棕榈酸盐
• 5 5mM UDCA
• 6 病理固定液（4%多聚甲醛溶液）
• 7 Western Blotting试剂的配制
• 7.1 10%过硫酸铵
• 7.2 四甲基乙二胺（TEMED）原液
• 7.3 SDS电泳缓冲液（5×）
• 7.4 转膜缓冲液
• 7.5 TBS缓冲液（10×）
• 7.6 TBST（1×）
• 8 Real-Time PCR试剂的配制
• 8.1 DEPC处理水
• 8.2 75%DEPC酒精
• 五、研究方法
• 1 激光共聚焦法小鼠肾脏冰冻切片钙神经蛋白及synatopodin表达测定
• 2 细胞培养和分组
• 2.1 细胞培养
• 2.2 细胞刺激
• 3 不同浓度棕榈酸盐刺激下足细胞钙神经蛋白的表达
• 3.1 细胞RNA提取
• 3.2 RNA鉴定
• 3.3 cDNA合成
• 3.4 引物设计
• 3.5 Real-Time PCR（SYBR Green染料法）
• 3.6 反应条件
• 4 激光共聚焦法测定钙神经蛋白的表达
• 5 Western Blotting检测足细胞钙神经蛋白、synaptopodin的表达
• 5.1 制胶
• 5.2 细胞裂解（细胞分组同免疫荧光部分）
• 5.3 BCA法测蛋白浓度
• 5.4 SDS-PAGE胶电泳
• 5.5 湿法电转膜
• 5.6 抗原检测
• 六、统计学处理
• 研究结果
• 一、激光共聚焦观察糖尿病小鼠模型中足细胞钙神经蛋白的表达
• 二、足细胞鉴定
• 三、体外足细胞在棕榈酸盐及熊去氧胆酸作用下钙神经蛋白的表达
• 1 不同浓度棕榈酸盐作用下体外足细胞钙神经蛋白的表达
• 1.1 细胞RNA提取
• 1.2 反应条件
• 1.3 解离曲线分析
• 1.4 明确目标条带
• 1.5 不同浓度棕榈酸盐作用下体外足细胞钙神经蛋白表达的定量
• 2 棕榈酸盐及熊去氧胆酸作用下体外足细胞钙神经蛋白的表达
• 2.1 激光共聚焦测定棕榈酸盐及熊去氧胆酸作用下体外足细胞钙神经蛋白的表达
• 2.2 Western Blotting检测棕榈酸盐及熊去氧胆酸作用下体外足细胞钙神经蛋白的表达
• 讨论
• 一、体外足细胞中棕榈酸盐刺激对钙神经蛋白表达的调控
• 二、体外足细胞中熊去氧胆酸刺激对钙神经蛋白表达的下调作用
• 三、钙神经蛋白与synaptopodin的表达关系
• 结论
• 论文综述
• 参考文献
• 致谢