论文摘要
背景:原发性肝细胞癌是一种严重危胁人类健康的常见恶性肿瘤之一[!],由于其起病隐匿、发展快、转移早、术后易复发等特点,死亡率较高。虽然原发性肝细胞癌的发病原因已经有较多研究,但确切的原因仍不十分清楚,所以防治十分困难。目前越来越多的研究者将注意力集中在肝癌的发病机理,明确发病机理,通过早期干预发病过程可能是防治原发性肝细胞癌的有效手段之一。近年来,国内外的研究发现wnt信号通路的异常激活与原发性肝细胞癌的发生、发展有密切关系,而β-catenin（β-连环素）又是wnt信号通路中的非常重要的蛋白之一,wnt信号主要通过调节β-catenin的表达来调节细胞的增生、分化和胚胎幼稚组织的发育,因此β-catenin可能在原发性肝细胞癌的发生、发展、分化和转移中有重要作用,通过调节β-catenin的表达可能对防治原发性肝细胞癌有积极意义。β-catenin在原发性肝细胞癌中的表达国内外均有报道,但是将正常肝组织、肝硬化和肝癌组织进行对比研究的报道甚少,这种表达是否与肝脏特殊的微环境和结构有关尚不清楚。我们通过动态观察β-catenin在这一发病过程中的异位表达情况,进一步说明β-catenin与肝癌的密切关系,对比研究β-catenin在体外培养的细胞株中的表达初步揭示这种表达与肝脏特殊的微环境和结构的关系,为临床治疗提供一定的理论依据。临床上发现大多数肝癌合并肝硬化,肝硬化患者肝癌的发病率较高,因此人们怀疑肝炎后肝硬化为肝细胞肝癌的癌前病变,但直接证据不足,难于揭示其中的机理,通过对比研究β-catenin的表达可能揭示肝硬化与肝癌的关系。近年来人们在肝癌、肝硬化组织中发现了肝干细胞即卵圆细胞（HOC）,该细胞具有较强的增生、分裂能力,推测肝癌来源于肝干细胞（HSC）的异常分化。目前关于肝干细胞的研究主要集中在形态和增生、诱导分化方面,从β-catenin的表达情况来说明其恶性转化的潜能的研究未见文献报道。因此通过分析β-catenin的异位表达来初步揭示原发性肝细胞癌的发生、分化、转移机理以及原发性肝癌与肝硬化和肝干细胞的关系,对于原发性肝细胞癌的临床防治和基础研究具有深远意义。目的:探讨β-catenin的异位表达在原发性肝癌的形成、发展、分化中的作用,为临床早期诊断、治疗和预后评估提供新的思路,为原发性肝细胞癌的干细胞起源和肝硬化与肝癌的关系提供理论证据。材料与方法:1.收集肝癌组织（40例）、正常肝组织（20例）、肝硬化组织（20例）,购买HepG2（人肝癌细胞株）、SMCC（人肝癌细胞株）、WB（大鼠肝干细胞）、L2（大鼠正常肝细胞）细胞株。2.利用免疫组织化学染色法和western-blotting法分析β-catenin在正常肝组织、肝硬化组织、肝癌组织以及高分化、中分化、低分化肝癌组织中的的表达差异。3.体外培养HepG2、SMCC、WB、L2细胞株。DMEM培养基体外培养肝HepG2、SMCC、L2, DMEMF12培养基体外培养WB。4.利用免疫荧光技术检测肝干细胞表面c-kit抗原来鉴定干细胞。5.HepG2、SMCC、WB、L2细胞株进行爬片培养,利用免疫细胞化学染色法和western-blotting法对比分析β-catenin在HepG2、SMCC、WB、L2细胞株的表达差异。结果1.免疫组织化学显示,正常肝组织中,β-catenin几乎全部分布于细胞膜,仅个别细胞的细胞浆中出现较浅的棕黄色染色。肝炎后肝硬化组织中大部分细胞膜上有明显的棕黄色染色,部分细胞的细胞浆中出现棕黄色染色其细胞膜和细胞核的异位表达与正常肝组织表达有差异(P<0.05﹚。原发性肝细胞癌组织中几乎所有的细胞膜未出现棕黄色染色,细胞膜表达有明显的缺失,大部分细胞浆中出现清晰的深棕黄色染色,高于肝炎后肝硬化组织(P<0.05﹚和正常肝组织(P<0.05﹚。Western-blotting法显示正常肝组织细胞浆中有少量β-catenin表达,细胞核中未见表达,肝癌组织细胞浆、细胞核中有明显积聚。2.在高分化肝癌组织中,部分细胞膜上有β-catenin表达,多数细胞浆中出现较浅的棕黄色染色,中分化肝癌组织中,细胞膜未见明显表达,大部分细胞浆中出现棕黄色染色,其染色程度较高分化为深。低分化肝癌组织所有的细胞膜未出现棕黄色染色,所有胞浆中出现清晰的深棕黄色染色,且染色较深。3.免疫荧光技术检测到肝干细胞表面c-kit抗原,WB细胞显示出较强的荧光（图15）。4.免疫细胞化学发现L2细胞株中β-catenin主要分布于细胞膜,细胞浆中未见明显表达。WB细胞中β-catenin在细胞浆有一定的表达,在HepG2、SMCC细胞株中β-catenin主要分布于细胞浆中,细胞膜未见明显表达。β-catenin在HepG2细胞株的胞浆表达多于SMCC。Western-blotting法显示,β-catenin在HepG2、SMCC的胞浆、胞核中的表达明显高于WB和L2细胞株,WB的胞浆、胞核中的表达高于L2细胞株,同时HepG2的胞浆、胞核中的表达高于SMCC细胞株。结论1.正常肝组织、肝硬化组织到原发性肝细胞癌组织β-catenin发生了由细胞膜向细胞浆、细胞核表达异常,这种异常表达在原发性肝细胞癌的形成、发展过程中可能具有重要作用。2.肝硬化可能为肝细胞癌的癌前病变。3.β-catenin由细胞膜向细胞浆、细胞核的异位表达与肝细胞癌的分化有关,异位表达愈明显,肝细胞癌的分化程度愈低。4.体外细胞培养的结果表明β-catenin的异常表达与肝脏的特殊结构以及肝脏特殊的微环境无关。5.WB细胞株的细胞浆和细胞核中的β-catenin表达明显多于L2肝细胞株。从L2、WB、SMCC、HepG2细胞株β-catenin在细胞浆和胞核中的表达逐渐增加。支持原发性肝细胞癌可能来源于肝干细胞。