多种营养因子联合对大鼠脊髓神经元作用的研究

论文摘要

由事故、坠落伤、重物砸伤及退变基础上加外部暴力等引起的脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）临床较为多见,SCI后出现脊髓出血、水肿、坏死、囊腔形成、退变胶质化等一系列病理改变,以致神经元丧失、轴突脱髓鞘,临床表现为不同程度的伤残。长期以来,国内外学者围绕SCI的治疗做了大量临床和实验研究,除手术治疗外,药物治疗也是非常重要的方面。治疗脊髓损伤的药物主要有保护药物和促进损伤修复的药物,其中神经营养因子（neurotrophic factor,NTF）兼有保护神经元细胞和促进神经元轴突生长等作用,成为研究的焦点。目前研究较多的神经营养因子有神经生长因子（nerve growth factor, NGF）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）、脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）、神经营养因子-3（neurotrophin-3,NT-3）,神经营养因子-4/5（neurotrophin-4/5,NT-4/5）等。NTF不仅在发育过程中调节神经元存活,在生化和生理上激活酶的活性发挥生理功能,而且还能阻止成年神经元损伤后的死亡,促使神经元修复、轴突再生、调节突触可塑性和神经递质等神经系统的活动。NGF、BDNF和bFGF是发现最早和研究最为广泛的NTF,其各自的保护受损神经元、促进神经元修复、促进轴突再生的作用已经有了较为深入的研究和系统的阐明,而且其获取手段已经较为简单,因此其作用确切、价格低廉、不受来源限制,成为最具潜力的供选因子。本实验采用神经元培养方法,将供选因子的不同组合作用于培养状态下的大鼠脊髓神经元细胞,测量神经元的活性及轴突生长情况,寻找能保护神经元细胞、促进轴突快速生长的的最佳方案,为临床和基础研究提供一个效果显著、成本低廉的NTF组配方案。实验第一部分应用酶消化法获得大鼠脊髓细胞,培养过程中使用阿糖胞苷纯化细胞,经β-tubulin3和Hoechst染色法确定培养神经元比例。纯化后的细胞加入终浓度为50ng/ml不同的双因子组合,研究并记录其生长特性和生物学特点。结果证实:1.实验应用阿糖胞苷纯化大鼠脊髓神经元细胞,方法简便,成本低廉,所获细胞贴壁率高、生长稳定、形态较为均一。应用此方法可以获得较纯且生长稳定的大鼠脊髓神经元细胞。2.在纯化后的细胞中加入不同的营养因子组合、单因子对照及空白对照,随时间各组细胞生长开始出现差异,主要在细胞突起长度和神经元存活率两个方面。各双因子组神经元存活率明显优于单因子组及对照组,在BDNF+bFGF组,其细胞突起长度明显优于其它双因子组和单因子组。证实在特定浓度下,BDNF+bFGF组合最有利于神经元存活和突起生长。实验第二部分采用BDNF和bFGF不同浓度的9种组合作用与脊髓神经元细胞,观察细胞生长状态,研究记录神经元的生长特点和生物学特性。结果证实:1.使用BDNF+bFGF组合可以有效维持神经元体外存活,在10ng/ml-100ng/ml浓度范围内,细胞存活率与因子浓度呈剂量依赖效应。较高浓度的因子可提高神经元的存活率。2.不同浓度的BDNF+bFGF组合对神经元突起生长促进存在差异,因子浓度在BDNF50ng/ml+bFGF100ng/ml、BDNF100ng/ml+bFGF50ng/ml、BDNF100ng/ml +bFGF100ng/ml时,神经元突起长度优于其它各联合应用组。综合两部分结果,可以得出BDNF100ng/ml +bFGF100ng/ml最适合神经元存活与突起生长。本实验成功获取了纯度较高的大鼠脊髓神经元细胞,并观察记录了其生长状态和生物学特性。应用不同的NTF组合作用于大鼠脊髓神经元细胞,经初步分析鉴定,证实BDNF+bFGF组合最有利于神经元存活与突起生长,且神经与存活率在一定浓度范围内呈剂量依赖效应,BDNF100ng/ml +bFGF100ng/ml最适合神经元存活与突起生长。为临床应用NTF治疗脊髓损伤和基础研究提供一定的理论依据。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 文献回顾
• 1 神经营养因子与神经再生
• 1.1 神经营养因子分类及其在损伤后的作用
• 1.2 神经生长因子
• 1.3 脑源性神经营养因子
• 1.4 碱性成纤维细胞生长因子
• 2 神经营养因子联合应用
• 正文
• 实验一 NGF、BDNF 和 bFGF 的不同组合对大鼠脊髓神经元的作用研究
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 脊髓神经元的取材、培养、纯化
• 2.2 免疫荧光染色及阳性率计算
• 2.3 神经元突起长度测量
• 2.4 MTT检测细胞活性及绘制生长曲线
• 2.5 统计学处理
• 3 结果
• 3.1 形态学观察
• 3.2 免疫荧光染色及阳性率
• 3.3 细胞突起长度测量
• 3.4 MTT法绘制生长曲线
• 4 讨论
• 实验二 不同浓度BDNF和bFGF组合对大鼠脊髓神经元的作用研究
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 脊髓神经元取材、培养、纯化
• 2.2 免疫荧光染色及阳性率计算
• 2.3 神经元突起长度测量
• 2.4 统计学处理
• 3 结果
• 3.1 形态学观察
• 3.2 免疫荧光染色及阳性率
• 3.3 细胞突起长度测量
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 个人简历和研究成果
• 致谢