论文摘要
马立克氏病病毒（Marek’s disease virus）的UL13基因与I型单纯疱疹病毒（HSV-1）UL13基因和水痘-带状疱疹病毒（VZV）的ORF47基因同源,编码一种被膜蛋白,分子量约5760kDa。现已证实,HSV-1 UL13和VZV ORF47具有蛋白激酶功能,能够对多种病毒蛋白和细胞蛋白进行磷酸化修饰。为了探讨MDV UL13的生物学特性和功能,本研究在克隆UL13基因的基础上通过分别构建UL13重组杆状病毒和原核表达质粒,成功获得了在昆虫细胞和大肠杆菌中的表达产物,同时研制出抗UL13C末端原核表达产物的单克隆抗体,为进一步探索MDV UL13发挥的生物学功能打下基础。一、MDV UL13基因的克隆及序列分析根据Genbank已发表的MDV GA株的序列,设计并合成一对UL13特异引物,用PCR扩增方法从MDV-1 CVI988株病毒感染的鸡胚成纤维细胞（CEF）总DNA中扩增出了UL13基因,将该基因插入pGEM T载体中进行测序验证,获得的序列与MDV-1其他毒株的UL13基因进行比较,结果发现该基因在MDV-1中高度保守,同源性达到了99.8%以上,仅在氨基酸192位GA株由Arg突变为Gln。用蛋白质数据库分析该序列发现,该基因编码的产物具有蛋白激酶的保守功能序列:在151AGSGSYGVV159中152、154、157位的G,159位的V与168AVKK171中的170位K共同参与结合ATP;在264LTHLDIKCGNIFV276序列中,268位D为质子受体,参与质子的转移,同时这段肽参与了与底物的结合,具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶特征。MDV-1 UL13基因与部分其他疱疹病毒科成员UL13基因及其同源物的同源性有9.1%～66.8%,但是各蛋白均含有真核细胞蛋白激酶的保守序列。上述分析提示MDV UL13基因也可能编码一种蛋白激酶,并具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性。二、MDV UL13基因在大肠杆菌中的表达及其抗血清的研制为了获得抗MDV UL13蛋白的抗体,本研究首先将UL13基因插入到原核表达载体pGEX-6P-1中与谷胱甘肽S转移酶（GST）进行融合表达,经过诱导证明全基因不能获得表达。根据大肠杆菌的密码子偏嗜性,将UL13基因分段UL13C（115-513aa）, UL13N（1-114aa）, UL13S（260-400aa）和UL13H（432-513aa）克隆,分别插入pGEX-6P-1载体中,与谷胱甘肽S转移酶GST蛋白融合表达。经过0.05mM IPTG诱导5hr后,收获细菌进行SDS-PAGE电泳分离,并经过Western blot验证,融合蛋白GST-UL13C,GST-UL13S和GST-UL13H获得了表达,且主要以包涵体形式存在。将原核表达的蛋白经过SDS-PAGE电泳分离,凝胶经过染色脱色后,将目的蛋白条带从凝胶中割出,用电洗脱的方式将UL13原核表达产物回收,并经SDS-PAGE和Western blot验证。将此电洗脱产物免疫小鼠,100μg /次,间隔2周,连续免疫4次后,眶下窦静脉采血分离血清。通过Western blot分析,结果该血清能与UL13和GST原核表达产物发生反应,说明通过电洗脱纯化的原核表达产物能够有效的刺激小鼠产生免疫反应。该研究也为检测UL13基因在昆虫细胞中的表达提供了重要的生物材料。三、MDV UL13基因在昆虫细胞中的表达及鉴定将UL13基因从pGEM-UL13载体经酶切,然后克隆到转移质粒载体pFastBac1TM中,将获得的重组质粒pFast-UL13转化DH10Bac感受态细菌,在辅助质粒的协助下发生转座,通过蓝白斑筛选挑取白色菌落扩大培养后,提取重组Bacmid DNA,并通过PCR鉴定重组杆状病毒rBacmid-UL13 DNA。将获得重组杆状病毒DNA通过脂质体介导,转染昆虫细胞sf9,培养7d后收获培养细胞和上清,并继代培养2代。提取培养上清中杆状病毒DNA,通过PCR方法鉴定重组杆状病毒rBac-UL13。运用研究二中制备的抗UL13蛋白的血清,通过间接IFA和Western blot技术证明了MDV UL13蛋白在昆虫细胞中获得了表达,为研究重组蛋白的体外激酶活性分析打下基础。四、抗MDV UL13蛋白单克隆抗体的研制通过杂交瘤技术,将免疫GST-UL13C原核表达产物小鼠（见研究二）的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0进行细胞融合, HAT选择性培养基培养10天后,将收取的上清与感染rBacmid-UL13的sf9细胞进行IFA试验,通过有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行亚克隆,最终获得了4株能分泌抗UL13蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为MDV-UL13-4H9,MDV-UL13-4G11,MDV-UL13-5D12,MDV-UL13-2A4。通过IFA试验验证,这些单克隆抗体不与rBacmid-VP2（IBDV）,rBacmid-NP（AIV）感染的sf9细胞反应,而与rBacmid-UL13感染的sf9细胞反应,证明是抗MDV UL13的特异性单克隆抗体。抗UL13蛋白单抗的获得为研究该蛋白的生物学功能提供了重要的生物材料。
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相关论文文献
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