基于核酸的荧光生物传感器研究

论文摘要

生物传感器的研究已经成为分析化学和生物化学领域中一个非常重要和令人感兴趣的课题,人们对此作出了深入广泛的研究。荧光化学传感器是依靠荧光信号为检测手段,通常有荧光的增强、淬灭或者发射波长的移动,具有方便快捷、较高的灵敏度与选择性、可以利用光纤技术实现距离实时检测等优点,已成为光化学传感器技术研究者们倍感兴趣的研究领域。蛋白质是一类重要的生物标志物,许多肿瘤生物标志物就属于酶类、抗原类物质及微球蛋白、铁蛋白等蛋白类物质。在食品中非法加入三聚氰胺引起的危害已经引起了社会的关注。因为三聚氰胺的含氮量达到66%,所以关于非法在食品中添加三聚氰胺增加食品含氮量的报道常常见于报端,发展快速简单的检测实际样品中三聚氰胺含量的方法是比较有用的。环境中的重金属离子难以被微生物降解,可通过各种途径进入人体并在体内长期积累,对身体造成危害,严重的将会危及生命。因此,建立简单、快捷、灵敏、实用的检测方法具有重要的意义。在本研究论文中,主要发展了几种荧光生物传感器。具体内容如下：（1）在本章中我们报道了一种基于小分子-DNA复合物末端保护原理检测蛋白的方法。首先小分子修饰DNA链,通过小分子和相应结合蛋白的特异性识别和RCA反应和ExoⅢ的放大实现对叶酸结合蛋白的检测。反应过程均在均相中进行,DNA链上的小分子和蛋白结合后,在溶液中加入具有消化DNA单链的Exo Ⅰ,得到保护的DNA就不能被水解；接下来引入环形探针,模板链和环形探针进行杂交反应后,加入大肠杆菌连结酶和连接缓冲液进行连结；加入引物,dNTPs和Bst聚合酶,RCA反应开始启动,生成了—条具有重复序列的单链；最后加入一条和RCA产物其中一段序列互补的taqman探针（荧光基团和淬灭基团比较靠近,单独存在时没有荧光）和ExoⅢ,RCA产物和taqman探针杂交后,ExoⅢ开始水解杂交上去的taqman探针,从而使得荧光基团和淬灭基团分离开来,溶液产生荧光。可以根据荧光强度定量叶酸结合蛋白的浓度。（2）在本章中建立了一种利用核酸染料Sybr Green Ⅰ快速检测三聚氰胺（melamine）的传感器技术。传感器构建的基础是三聚氰胺诱使单链改变构型变成双链,在双链核酸染料的存在下引起荧光的差异到达检测分析物的目的。Sybr Green Ⅰ是一种双链核酸染料,和单链的结合力很弱,所以如果缓冲液只含有Sybr Green Ⅰ和polyT24时,溶液的荧光强度是很弱的。在加入目标物的情况下,三聚氰胺和胸腺嘧啶之间由于氢键的形成,从而可以形成T-melamien-T的构象,导致聚T链从单链构型改变其形态形成发夹的结构,染料可以很好的嵌入双链中,溶液可产生强荧光。检测下限低于国际标准的食品中三聚氰胺含量。这种检测方法简单,快速。（3）因为银离子对水中生物有毒害作用,而且其广泛应用于电解工业、摄影、成像工业和医药。研究工作者已经利用有机荧光物质和量子点发展了快速、简易的化学传感器检测水中的银离子,但是这些传感器有些限制,比如比较低的水溶性、不够灵敏。在第四章中报道了一种基于银离子（Ag+）和胞嘧啶（C）之间的特异性识别的无标记的荧光检测方法,用来检测银离子。C-Ag+-C结构的形成诱使富C的DNA链折叠,引入Sybr Green Ⅰ后,即可得到明显增强的荧光信号。该方法简单、快速、成本低。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 第1章 绪论
• 1.1 生物传感器
• 1.1.1 生物传感器的基本组成和工作原理
• 1.1.2 生物传感器的分类
• 1.1.3 生物传感器的特点
• 1.1.4 生物传感器的应用和展望
• 1.2 荧光生物传感器
• 1.2.1 荧光产生原理
• 1.2.2 荧光传感器的应用
• 1.3 滚环扩增（RCA）技术
• 1.3.1 滚环扩增的原理
• 1.3.2 滚环扩增的分类
• 1.3.3 滚环扩增的优势和不足
• 1.3.4 滚环扩增的应用
• 1.4 本研究工作的构思
• 第2章 基于DNA末端保护检测蛋白质的荧光分析方法
• 2.1 前言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 试剂与仪器
• 2.2.2 叶酸的标记和连接探针的末端保护
• 2.2.3 RCA反应过程
• 2.2.4 ExoⅢ的循环放大过程
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 传感器的设计原理
• 2.3.2 传感器的光谱图和凝胶电泳图表征
• 2.3.3 RCA反应时间对传感器性能的影响
• 2.3.4 ExoⅢ浓度对传感器性能的影响
• 2.3.5 传感器的分析性能
• 2.3.6 传感器的特异性评价
• 2.4 小结
• 第3章 基于单链DNA构型转变用于三聚氰胺的检测
• 3.1 前言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 试剂和仪器
• 3.2.2 三聚氰胺的检测过程
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 三聚氰胺传感器的检测原理
• 3.3.2 传感器的荧光发射光谱表征
• 3.3.3 传感器的紫外可见光谱表征
• 3.3.4 实验条件的优化
• 3.3.5 传感器的分析性能
• 3.3.6 实际样品的检测
• 3.4 小结
• 第4章 基于寡核苷酸为荧光探针用于银离子的超灵敏检测
• 4.1 前言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 试剂和仪器
• 4.2.2 银离子的检测
• 4.3 结果和讨论
• 4.3.1 传感器的设计原理
• 4.3.2 荧光发射光谱表征
• 4.3.3 实验条件的优化
• 4.3.4 传感器的分析性能
• 4.3.5 其他离子的干扰试验
• 4.3.6 水样中银离子的检测
• 4.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢