论文摘要
精原干细胞（spermatogonial stem cells, SSCs）的体外培养与分化研究是近年来生殖生物学的研究热点,也是揭示精子发生机理的新途径。许多的研究已经表明,SSCs的体外增殖需要饲养层细胞和多种生长因子的支持。在睾丸曲细精管中,支持细胞（Sertoli cells）是生精上皮中的唯一体细胞,为生精细胞发育提供必要的营养和生长因子,包括胶质细胞源神经营养因子（glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF）和成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor, FGF）等。研究还表明,睾丸中的Sertoli’s细胞等分泌GDNF,并且在体外培养SSCs时,高浓度的GDNF促进SSCs的增殖,低浓度的GDNF会促进SSCs分化。因此,在本研究中,我们首先通过分离和培养小鼠睾丸的Sertoli’s细胞,获得Sertoli’s细胞纯培养物,然后从培养的Sertoli’s细胞中克隆gdnf基因,转入到睾丸支持细胞系TM4中表达,意在得到超表达GDNF的TM4细胞作为SSCs培养时的饲养层细胞,达到SSCs长期培养的目的。为获得高纯度的Sertoli’s细胞培养物,我们对已经报道的方法进行了改良。此改良方法主要包括二步酶消化、分级离心和差异贴壁分选等。所用小鼠是出生后0-5天的昆明白乳鼠。通过形态学观察和Sertoli’s细胞标志分子vimentin的免疫细胞化方法来确定Sertoli’s细胞的纯度。在分子生物学操作时,我们应用Trizol试剂法提取培养的Sertoli’s细胞的总RNA,通过RT-PCR方法获得gdnf基因,应用T4 DNA连接酶将gdnf基因克隆到pMD-T载体上,然后转化感受态大肠杆菌DH5,并筛选出阳性重组子。在基因测序正确后,将gdnf基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1上。通过脂质体法转染培养的TM4细胞,利用G418筛选获得阳性TM4细胞并进行克隆培养。为验证gdnf基因在转基因TM4细胞中的表达状况,我们进行了免疫细胞化学和Western bloting检测。对培养的睾丸细胞培养物的形态学观察表明,培养细胞的形态符合各文献报道的Sertoli’s细胞的特征；vimentin免疫细胞化学检测表明,98%以上的培养细胞是vimentin阳性细胞,也就是说培养物是高纯度的Sertoli’s细胞。Sertoli’s细胞在体外培养时,不能长期保持。一般情况下,细胞只能传代3-5次,维持增殖时间在20天左右。对我们所提取的支持细胞总RNA,琼脂糖甲醛变性凝胶电泳检测表明无明显降解,完整性好；对RT-PCR法克隆的gdnf基因的琼脂糖凝胶电泳结果表明,条带符合预期的大小；测序结果表明,克隆的gdnf基因序列正确,我们已经扩增出了gdnf目的基因；对重组质粒pcDNA3.1-gdnf双酶切结果显示,gdnf真核表达载体构建正确；通过提取转gdnf基因的TM4细胞的总RNA,利用gdnf基因的特异性引物所进行的RT-PCR结果表明,gdnf基因在转基因TM4细胞中有表达；应用兔抗小鼠GDNF抗体进行的免疫细胞化学检测和Western Blot显示,实验组TM4细胞中有高效的gdnf基因表达。总之,通过本研究,我们成功的高纯度的分离和培养了小鼠Sertoli’s细胞,从培养的Sertoli’s细胞中克隆了gdnf基因,并获得了高表达GDNF的转基因TM4细胞系。