玉米芯木聚糖硫酸酯的制备及其抗炎活性研究

论文摘要

木聚糖属于半纤维素,是自然界中最为广泛存在的多糖之一,几乎所有的植物中都有木聚糖的存在。木聚糖本身具有多种生物活性,如提高免疫力、抗肿瘤、抗氧化等,其硫酸酯衍生物因具有更好的水溶性和更广泛的生物活性而受到人们越来越多的关注和重视。榉木木聚糖硫酸酯具有抗炎、抗肿瘤、抗病毒、抗凝等生物活性,尤其是抗炎活性已得到广泛认可,且已有榉木木聚糖硫酸酯为主成分的抗炎药-—木聚硫钠（pentosan polysulfate sodium, PPS）上市。PPS是由毗喃木糖经β-1,4糖苷键连接形成木糖主链,其侧链羟基均被硫酸基取代的一种多糖,具有抗间质性膀胱炎和抗骨关节炎的作用。但榉木木材来源有限价格昂贵,有报道称廉价易得的玉米芯中也含有大量的木聚糖。基于此,本课题以玉米芯为原料碱法提取木聚糖,选择合适的酯化体系,磺化修饰制备木聚糖硫酸酯；筛选出较高活性产物的制备方法,分析结构特征,并初步验证玉米芯木聚糖硫酸酯的抗炎活性。本课题取得的研究结果和结论主要有以下几个方面：1玉米芯木聚糖提取条件的优化及分离鉴定通过对提取条件的摸索,确定了碱法提取玉米芯木聚糖的最佳条件为：提取前先在沸水中处理,然后以15倍体积的浓度15%的NaOH溶液,在80℃条件下提取2h。根据在水中溶解性能的不同,木聚糖分水溶性木聚糖和水不溶性木聚糖,分别采用水沉法和醇沉法分离得到这两种多糖,二者比例约为2.4:1。紫外全波长扫描显示,水不溶性木聚糖中蛋白质和果胶色素等杂质较少,反复用蒸馏水洗即能除去；水溶性木聚糖含较多杂质,确定了用木瓜蛋白酶-Sevage法去除水溶性玉米芯木聚糖中的蛋白效果较好。薄层层析和气象色谱证实,水不溶性玉米芯木聚糖单糖组成中几乎只含有木糖和阿拉伯糖,水溶性玉米芯木聚糖单糖组分较复杂,除木糖和阿拉伯糖外,还有葡萄糖和半乳糖；此外,由GC图谱推测水不溶性玉米芯木聚糖木糖和阿拉伯糖比例约为4:1。2玉米芯木聚糖硫酸酯制备和活性筛选从以氯磺酸/甲酰胺、氯磺酸/吡啶、三氧化硫吡啶复合物/吡啶、三氧化硫吡啶复合物/N,N-二甲基甲酰胺搭配组成的四种酯化体系对玉米芯木聚糖进行酯化反应,比较各体系对玉米芯木聚糖的反应性能,并结合酯化产物产率和硫酸根取代度结果确定了最适于水不溶性玉米芯木聚糖的酯化体系为三氧化硫吡啶复合物/N,N-二甲基甲酰胺体系。为研究木聚糖硫酸根取代度与活性间的关系,分别用1、3、5倍于木聚糖的三氧化硫吡啶复合物与木聚糖进行反应,制备三种酯化产物,测得其硫酸根取代度分别为0.354、0.887、0.370,以MTT法检测这三种酯化产物对大鼠巨噬细胞活力影响,规律为：硫酸基取代越高者对巨噬细胞活力抑制作用越强,且药品浓度越大,作用时间越久,效果越好。3玉米芯木聚糖硫酸酯的结构研究通过对酯化反应主要影响因素的考察,确定了制备高活性木聚糖硫酸酯的最佳工艺条件为：木聚糖与5倍质量的三氧化硫吡啶复合物在70℃条件下反应6h以上,在此条件下酯化产物经离子柱和凝胶柱层析得到较纯净的玉米芯木聚糖硫酸酯,测得其旋光度值为-73.2°,硫酸根取代度为1.571,分子量为26.424kDa。利用紫外扫描光谱（UV）、红外光谱（IR）、核磁共振光谱（1H-NMR、13C-NMR）分析结果,辅以旋光度值和气相色谱结果可以大体确定水不溶性玉米芯木聚糖硫酸酯的分子结构。UV结果显示,产物中确有硫酸基团,且不含核酸、蛋白等杂质；IR结果进一步证明了分子结构中含有硫酸基团取代的木聚糖,对NMR图谱进行分析,结合文献可大体对其进行信号归属。4玉米芯木聚糖硫酸酯抗炎活性水不溶性玉米芯木聚糖硫酸酯在多种急慢性炎症模型中均有明显的抗炎作用,且抗炎作用具有剂量依赖性。其中25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg的给药剂量对鼠耳肿胀模型均有明显的抑制作用,与模型组相比抑制率分别为（44.793±0.079）%、（51.407±0.324）%、（57.466±0.292）%。各给药剂量对血管通透性有明显抑制作用,与模型组的伊文思蓝渗出浓度（2.678±0.053）μg/mL相比,各剂量组对应值（2.441±0.051）μg/mL、（2.382±0.044）μg/mL、（1.890±0.041）μg/mL均显著降低。100mg/kg的给药剂量对肉芽肿的抑制率为（37.463±9.757）%,25mg/kg和50mg/kg的给药剂量对抑制肉芽肿生成作用不明显。三个剂量组的TNF-α含量分别为（401.72±63.61）pg/mL、（191.79±47.67）pg/mL、（148.67±30.00） pg/mL,与模型组的对应值（838.67±93.34）pg/mL相比均有显著性差异。三个剂量组的IL-1β含量分别为（58.68±31.34）pg/mL、（53.08±26.78） pg/mL、（35.48±12.40） pg/mL,仅高剂量组与模型组对应值（71.48±12.81）pg/mL相比有显著性差异。三个剂量组的NO含量分别为（31.64±0.57）μmol/L、（30.13±0.76）μmol/L、（26.92±1.70）μmol/L,与模型组对应值（32.77±0.75）μmol/L相比,仅高剂量组有显著降低NO的作用。炎症组织HE染色现象也直观说明玉米芯木聚糖硫酸酯可以通过降低血管通透性、减少炎症细胞渗出两方面抑制炎症反应。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 符号说明
• 第一章 前言
• 1 炎症与疾病
• 1.1 炎症与心血管病
• 1.2 炎症与糖尿病
• 1.3 炎症与阿尔茨海默症
• 1.4 炎症与癌症
• 2 木聚糖及其衍生物的活性
• 2.1 木聚糖的活性
• 2.2 多硫酸化木聚糖的活性
• 3 木聚糖硫酸酯作用机制
• 3.1 PPS作用细胞
• 3.2 PPS相关因子
• 4 木聚糖来源简介
• 5 木聚糖及其硫酸酯的制备方法介绍
• 6 本课题拟解决的问题
• 第二章 玉米芯木聚糖提取条件的优化及分离鉴定
• 1 材料和仪器
• 1.1 试剂
• 1.2 仪器
• 2 方法
• 2.1 木聚糖提取条件的优化
• 2.2 木聚糖的分离纯化
• 2.3 玉米芯木聚糖理化性质测定
• 2.4 木聚糖组成成分分析
• 3 结果
• 3.1 最佳提取条件的确立
• 3.2 木聚糖的分离及纯化
• 3.3 理化性质的测定
• 3.4 CCX单糖组分分析
• 4 讨论
• 5 小结
• 第三章 玉米芯木聚糖硫酸酯制备体系确定及活性筛选
• 1 材料和仪器
• 1.1 试剂
• 1.2 仪器
• 1.3 实验动物
• 2 方法
• 2.1 WIS-CCX酯化体系的筛选
• 2.2 三种不同酯化产物的制备
• 2.3 硫酸根含量测定
• 2.4 红外光谱特征
• 2.5 三种不同酯化产物对巨噬细胞活力的影响
• 2.6 数据处理
• 3 结果
• 3.1 酯化体系的确立
• 3.2 WISX-S1、WISX-S2及WISX-S3的硫酸根取代度
• 3.3 WISX-S1,WISX-S2及WISX-S3的红外光谱特征
• 3.4 WISX-S1、WISX-S2及WISX-S3对巨噬细胞活力的影响
• 4 讨论
• 5 小结
• 第四章 WISX-S制备方法的优化及结构特征分析
• 1 材料
• 1.1 试剂
• 1.2 仪器
• 2 方法
• 2.1 硫酸酯化条件的确立
• 2.2 酯化产物的纯化脱盐
• 2.3 WISX-S的理化性质测定
• 2.4 WISX-S纯度测定
• 2.5 WISX-S紫外光谱测定
• 2.6 WISX-S红外光谱测定
• 2.7 WISX-S核磁共振图谱测定
• 3 结果
• 3.1 硫酸酯化条件的确立
• 3.2 纯化脱盐
• 3.3 WISX-S部分理化性质测定
• 3.4 WISX-S的纯度测定结果
• 3.5 WISX-S的紫外扫描结果
• 3.6 WISX-S的红外光谱测定
• 3.7 WISX-S的核磁共振测定结果
• 4 讨论
• 5 小结
• 第五章 WISX-S对小鼠急慢性炎症的作用研究
• 1 材料
• 1.1 试剂
• 1.2 仪器
• 1.3 实验动物
• 2 方法
• 2.1 溶液的配制
• 2.2 小鼠外耳廓肿胀急性炎症模型测炎法
• 2.3 WISX-S对小鼠皮肤毛细血管通透性的影响
• 2.4 小鼠足趾肿胀急性炎症模型测炎法
• 2.5 急性炎症标本收集及组织形态学检查
• 2.6 WISX-S对小鼠慢性炎症的作用
• 2.7 血清学检查
• 2.8 数据处理
• 3 结果
• 3.1 WISX-S对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响
• 3.2 WISX-S对急性炎症中血管通透性的影响
• 3.3 鼠耳肿胀炎症灶病理学检验
• 3.4 足趾肿胀炎症灶病理学检验
• 3.5 WISX-S对棉球肉芽肿形成的影响
• 3.6 WISX-S对小鼠血清TNF-α含量的影响
• 3.7 WISX-S对小鼠血清IL-1β含量的影响
• 3.8 WISX-S对小鼠血清NO含量的影响
• 4 讨论
• 5 小结
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文
• 论文评阅及答辩情况表