禽流感病毒M2重组多肽疫苗及人角质细胞生长因子转化番茄初探

论文摘要

禽流感（Avian Influenza,AI）是由正粘病毒科A型流感病毒引起的一种以侵害呼吸系统为主的高度接触性传染病。其高致病力毒株可引起90%以上的死亡率,每次爆发都给养禽业带来巨大的经济损失,因此被国际兽疫局列为Ⅰ类烈性传染病。禽流感病毒M2蛋白是由97个氨基酸组成的寡四聚体,与HA和NA基因相比,M2基因具有高度保守性。因此,与其他禽流感多肽疫苗相比,M2蛋白具有交叉保护能力的“通用”流感疫苗研究的候选抗原的优势。人角质细胞生长因子（Keratinocyte growth factor,KGF）是由163个氨基酸残基组成的26-28 KD单链多肽。KGF对皮肤创面的上皮细胞具有促进增殖、促进创面愈合的作用,也在精囊腺、卵泡等组织、器官的发育过程中起重要作用。因此,KGF常被用于治疗胃肠系统溃疡、皮肤损伤等疾病。植物作为生物反应器应用于疫苗、抗体等药用蛋白的生产,具有经济效益高、可大规模生产、可直接食用等优点。番茄是全球种植最广泛、消费最多的蔬菜作物之一,营养丰富,是生食、熟食的美味佳品。因此利用番茄作为生物反应器生产禽流感疫苗及高活性KGF将具有重要的商业价值。本实验研究了6-BA、Zt分别与IAA组合对番茄子叶再生的影响,优化了番茄转化的方法。结果表明在Zt浓度为0.5 mg/L时番茄子叶再生芽率（93.33%）和正常芽率（36.37%）均为最高。在植物转化中,我们利用农杆菌介导的转化方法将LBM2eHBc+融合基因转入中蔬5号番茄中,获得再生无菌苗34株,经PCR检测,阳性率为75.0%。同时,我们还将KGF基因连接到表达载体pBI121中,利用农杆菌介导方法转化番茄得到再生植株12株,经PCR检测部分植株为阳性。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 植物生物反应器概述
• 1.1.1 植物生物反应器的优点
• 1.1.2 植物作为生物反应器的应用
• 1.1.3 植物生物反应器的局限性
• 1.1.4 植物作为生物反应器前景
• 1.2 禽流感研究进展
• 1.2.1 禽流感概述
• 1.2.2 禽流感疫苗研究进展
• 1.2.3 禽流感M2蛋白
• 1.3 KGF概述
• 1.3.1 KGF的结构
• 1.3.2 KGF的生物学功能
• 1.3.3 KGF在医学上的应用
• 1.4 本研究的意义和内容
• 2 材料与方法
• 2.1 材料及仪器设备
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株和质粒
• 2.1.3 主要化学试剂及仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 番茄再生系统的优化（培养基见附录）
• 2.2.2 KGF植物表达载体的构建
• 2.2.3 KGF工程菌的制备
• 2.2.4 农杆菌侵染外植体
• 2.2.5 再生植株的获得
• 2.2.6 再生植株移栽
• 2.2.7 转基因再生苗的PCR鉴定
• 3 结果与分析
• 3.1 番茄子叶再生体系的优化
• 3.1.1 6-BA对番茄子叶再生的影响
• 3.1.2 IAA对番茄子叶再生的影响
• 3.1.3 Zt对番茄子叶再生的影响
• 3.1.4 IAA对番茄再生苗生根的影响
• 3.2 Kan筛选压的确定
• 3.3 植物表达载体pBI121-KGF的构建
• 3.4 转基因植株再生
• 3.5 转基因植株PCR鉴定
• 3.5.1 转LBM2eHBc+番茄PCR鉴定
• 3.5.2 转KGF基因番茄PCR鉴定
• 4 讨论
• 4.1 植物表达载体的选择
• 4.2 番茄的子叶外植体再生
• 4.3 不同外植体对分化的影响
• 4.4 农杆菌菌株的选择
• 4.5 农杆菌与再生之间的矛盾及农杆菌污染问题
• 4.6 子叶培养中畸形芽的问题
• 4.7 抗性苗驯化
• 4.8 生产口服植物疫苗的可行性
• 总结
• 参考文献
• 缩略词
• 附录
• 致谢