农杆菌介导的红曲菌M-7转化库中部分突变子的特性研究

论文摘要

本研究以农杆菌介导的红曲菌转化库中的8 132株转化子为材料,通过菌落形态观察结合显微特征分析,筛选获得一批形态特征变化显著的转化子,并将其分为七类。在此基础上,对转化子的主要代谢产物进行了分析,为从基因水平上阐述红曲菌代谢产物的合成调控机理提供了材料。主要研究结果如下。1.农杆菌介导的红曲菌T-DNA插入突变库的扩建参照实验室以前建立的农杆菌介导法转化红色红曲菌（Monascus ruber）M-7的条件:出发菌株M-7在麦芽汁培养基上30℃培养20 d,红曲菌孢子浓度为105个/mL,农杆菌的浓度OD600为0.5,诱导剂AS浓度为80 mmol/L,农杆菌与红曲孢子混合液于30℃共培养3 d,将转化库从5 132转化子扩增至8 132个转化子。2.转化子筛选及形态观察将8 132个转化子分别接种在PDA培养基上,30℃培养15 d。通过菌落形态观察,获得230株在菌落颜色、生长速度和气生菌丝等方面都与出发菌株M-7有明显差异的转化子,并将其分为七类:（1）菌落直较径大,菌落呈年轮状分布;（2）菌落直径较大,菌落颜色较浅,气生菌丝呈从卷毛状;（3）菌落直径较大,菌落颜色较浅,气生菌丝呈流苏状;（4）菌落直径较大,菌落颜色较深,气生菌丝呈从卷毛状;（5）菌落直径较小,菌落平坦,气生菌丝呈从卷毛状;（6）菌落直径较小,菌落中部隆起,气生菌丝较短;（7）菌落直径中等,菌落有扇形分化。从每一类中再挑选一些具有代表性的菌株进行显微形态观察,结果显示,转化子在分生孢子形状、菌丝表面附着物、闭囊壳的数量和形态上也发生较大变化。3.部分转化子的PCR鉴定及稳定性研究从上述230株将转化子中挑选35株接种于不含潮霉素的PDA培养基上,25℃培养7 d,连续转接5代后,再转接到含有50μg/mL潮霉素的PDA平板上,以出发菌株M-7作为对照,观察菌落在抗性培养基上的生长状况并计数。从35株转化子中挑选14株代表菌株,提取基因组并进行PCR鉴定（根据T-DNA上的gus基因设计引物）。结果显示上述14株转化子经过5轮培养后,仍能在含50μg/mL潮霉素的PDA平板上生长,抗性稳定性达88.57%,并且14株转化子的基因组中均有T-DNA插入。4.部分转化子蛋白酶和淀粉酶活的分析采用DNS法、Folin法等方法测定了上述14株转化子固态发酵产物——红曲的淀粉酶活、蛋白酶活,并结合淀粉聚丙烯酰胺凝胶电泳（Starch-PAGE）的方法比较不同转化子淀粉酶组份和活性差异。结果如下:有13株转化子红曲的淀粉酶活高于M-7的淀粉酶活160.45 U/g,其中1067#约为M-7的20倍,达3227.10 U/g;大部分的供试菌株蛋白酶均高于M-7,其中878#的酸性蛋白酶活最高,达1543 U/g,约为M-7的2倍;1067#的中性蛋白酶活最高,达3211 U/g,约为M-7的4倍;2225#的碱性蛋白酶活最高,达1773 U/g,约为M-7的4倍。采用Starch-PAGE能够有效的检测淀粉酶活性组分,结果显示活性组分越多,淀粉酶活力越高。5.部分转化子次生代谢产物的分析采用UV-VIS、TLC、HPLC、ELISA等方法测定了14株转化子红曲的色价、Monacolin K、γ-氨基丁酸和桔霉素的含量。结果表明,与出发菌株相比,突变株产次级代谢产物的能力都发生了不同程度的变化。14株转化子的红曲色价值均低于出发菌株M-7的色价4350 u/g,其中806#和2553#的色价分别为180 u/g和328u/g,不到M-7的1/10;10株突菌株红曲的Monacolin K含量高于M-7,其中3245#的Monacolin K含量约为M-7的10倍,分别为679.25μg/g和69.75μg/g;GABA含量方面,以178#制备的红曲GABA含量最高,达1.455g/Kg,约为M-7的3倍;由1822#制备的红曲的桔霉素含量最高,为60.01 ng/g,而806#与178#制备的红曲的桔霉素含量在实验条件下未检测到。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 第一章 文献综述
• 1 红曲与红曲菌
• 1.1 红曲
• 1.2 红曲菌
• 1.2.1 红曲菌的生物学特征
• 1.2.2 红曲菌的分类
• 2 红曲菌的主要代谢产物
• 2.1 酶类活性物质
• 2.2 红曲色素
• 2.2.1 红曲色素的分类
• 2.2.2 红曲色素的应用
• 2.3 莫呐可啉K（Monacolin K）
• 2.3.1 Monacolin K的性质与抑制胆固醇合成的机理
• 2.3.2 Monacolin K的检测
• 2.3.3 Monacolin K的应用
• 2.4 γ-氨基丁酸（GABA）
• 2.4.1 GABA的性质
• 2.4.2 GABA的测定
• 2.5 红曲中的桔霉素
• 2.5.1 桔霉素的性质
• 2.5.2 桔霉素的检测
• 2.6 其他活性物质
• 3 红曲菌遗传转化研究
• 4 本研究的目的及意义
• 第二章 转化库的扩增、筛选及其遗传稳定性分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 试剂
• 1.1.4 引物
• 1.1.5 主要仪器设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 转化库的扩建
• 1.2.2 转化子的筛选
• 1.2.3 转化子的形态观察及分类
• 1.2.4 转化子的遗传稳定性研究
• 2 结果与分析
• 2.1 转化库的扩增
• 2.2 转化子的筛选
• 2.3 转化子的形态观察及分类
• 2.3.1 转化子的菌落形态观察及分类
• 2.3.2 转化子的显微形态观察
• 2.4 转化子的稳定性分析
• 2.5 转化子的PCR鉴定
• 3 讨论
• 3.1 农杆菌介导的红曲菌转化
• 3.2 T-DNA的插入对红曲菌形态的影响
• 第三章 转化子的蛋白酶活和淀粉酶活的分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 试剂
• 1.1.4 主要仪器设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 红曲的制备
• 1.2.2 固态发酵淀粉酶活的测定
• 1.2.3 淀粉酶的性质研究
• 1.2.4 固态发酵蛋白酶活的测定
• 1.2.5 蛋白酶的性质研究
• 2 结果与分析
• 2.1 转化子淀粉酶活的测定
• 2.2 淀粉酶性质研究
• 2.2.1 固态发酵培养基质量变化的测定
• 2.2.2 淀粉酶最适反应pH及其酸碱稳定性的变化
• 2.2.3 淀粉酶最适反应温度及其稳定性的变化
• 2.2.4 Starch-PAGE检测淀粉酶活性组分
• 2.3 转化子蛋白酶活的测定
• 2.4 蛋白酶性质研究
• 2.4.1 蛋白酶最适反应pH及其酸碱稳定性的变化
• 2.4.2 蛋白酶最适反应温度及其稳定性的变化
• 第四章 转化子的次级代谢产物分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 ELISA检测材料
• 1.1.4 试剂
• 1.1.5 主要仪器设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 红曲米的制备
• 1.2.2 色价的测定
• 1.2.3 Monacolin K的测定
• 1.2.4 GABA的测定
• 1.2.5 桔霉素的测定
• 2 结果与分析
• 2.1 色价的测定与紫外扫描分析
• 2.1.1 色价的测定
• 2.1.2 紫外扫描分析
• 2.2 Monacolin K的测定分析
• 2.2.1 Monacolin K的TLC分析
• 2.2.2 Monacolin K的HPLC测定
• 2.3 GABA的测定分析
• 2.3.1 GABA的TLC分析
• 2.3.2 GABA的比色法测定
• 2.4 桔霉素的测定分析
• 2.4.1 桔霉素的TLC分析
• 2.4.2 桔霉素的ELISA测定
• 3 讨论
• 结论与讨论
• 1 结论
• 2 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 附录 读研期间发表的论文