局部植入治疗骨与关节结核药物缓释体的制备与特性研究

论文摘要

最近几年来的流行病学调查表明,全球结核病的发病率呈增高趋势。根据调查估计,全球现有的结核病人约2000万,我国现在患结核病的人数居世界第二位,约有结核病患者500万左右。在所有结核病患者中,患有骨与关节结核的病人约占1%2%。随着艾滋病患病率的逐年增高和各种免疫抑制剂的使用增多,其患病人数也呈逐年递增趋势。在众多骨与关节结核病的治疗方法中,主要的方法有药物治疗和外科手术治疗两种。很多骨与关节结核的病人,尤其是有明显的骨、关节破坏并导致临床严重症状的病人,最后往往需要行病灶清除等外科手术干预。随着近年来内固定材料的发展,对于较严重的骨与关节结核病人的治疗,目前多倾向于尽早行骨结核病灶清除+植骨重建内固定术。但是,在行骨结核病灶清除后,由于骨质破坏较多,残腔骨缺损严重,往往引起临床上局部残腔重建困难,尤其是脊柱及四肢的较大的骨与关节周围的严重结核病灶。同时,局部残留的结核杆菌也容易导致骨结核复发,这可能导致自体或人工骨移植失败,引起脊柱的后突畸形或脊髓受压以及关节畸形等远期并发症。另外,在行病灶清理术后,病人仍旧需要全身同时使用多种抗结核药物,且需要很长的治疗时间,一般至少6～9个月。抗结核菌的药物的毒副作用较为明显,多种药物、长疗程的治疗,全身用药毒副作用增大,每天都要服药,病人依从性差。有鉴于此,许多研究者或骨科医生开始尝试局部放置抗结核药物。但骨关节结核病灶清除后单纯的局部放置抗结核药物,药物浓度难以控制,持续时间较短,容易被引流到体外,且由于术后体位及重力等原因,难以在残腔内全方位立体释放。因此,合成一种既具有充填重建、诱导成骨作用,又具有持续立体缓释抗结核药物作用的缓释骨替代材料支架复合体,是目前临床上行骨与关节结核病灶清除术的迫切需要。在目前常用来研究的抗结核药物缓释载体中,研究较多的是有机高分子材料。但有极高分子缓释材料机械强度低,化学稳定性差,在体内容易被生物酶降解而发生崩解释放,且其内所结合的药物难以实现零释放。就其制作合成工艺而言,其载药过程是直接将药物加压沉积于载体上,仅使载体和药物进行简单的机械性混合,药物很难均匀地分散在载体基质上。同时,所合成的有机缓释载药材料质地也不均匀,从而直接影响到药物的释放速率和浓度。介孔二氧化硅材料是一种无机材料,孔径在2～50nm之间,具有如下特性:高比表面积,高孔容,高度有序的孔道结构,孔径和孔道结构可控,化学稳定性好,结构稳定;良好的生物兼容性和生物可降解性,孔道内外易于化学改性,可以实现良好的药物控释。由于介孔二氧化硅具有以上这些明显的优点,现已作为载药缓释材料被深入研究和使用。鉴于介孔二氧化硅为无机材料,且是一种很好的缓释药物的载体,并能较方便可靠地和无机材料支架进行有效的复合,故而成为本课题所选的缓释载体材料。由于单一使用抗结核药物容易导致菌抗药性结核杆的出现,故临床使用抗结核药物现在都采用联合用药,其中最常用的效果比较肯定且贯穿整个疗程的的两种药物是INH和RFP,有文献已经证实,将二者共同包封同时使用,药物疗效和安全性良好。对于支架材料的选择,考虑到缓释微球的结合,我们选择多孔β-磷酸三钙生物陶瓷（β-TCP）这一比较成熟的骨替代支架材料。综上所述,本实验拟将介孔二氧化硅缓释微球材料复合到多孔β-TCP组织工程骨支架材料中,并将INH和RFP共同包封其中。而后对其进行检测和缓释性能的验证,以期望这种复合体能够在动物体内的局部立体空间内,全方位、长时间地释放所包封的抗结核药物;同时还可以起到骨缺损的充填和促进成骨,加快重建的作用。通过对合成方法的探索以及对合成材料理化性能的检测、以及其体内外释放抗结核药物特性的检测和对成骨作用的观察,为其最终能应用于临床提供理论和实验支持。实验第一部分:INH-RFP/BG-MSN/β-TCP缓释复合体的制备及表征目的:旨在通过实验室合成INH-RFP/BG-MSN/β-TCP复合缓释材料（CS- DDS）,明确其形貌特征。方法:通过化学方法合成MSNs,在300℃条件下将其与β-TCP复合,真空负压吸引法包封INH和RFP,而后涂覆BG,场发射扫描电镜（FE-SEM）观察分析复合材料的晶相组成、微观形貌、化学结构和热稳定性,HPLC检测其载药率。结果:MSNs粒子为介孔材料,主要分布在40nm左右,介孔分布呈有序的柱状排列。介孔的表面积、孔容积及孔径大小分别为958m2/g, 0.91cm3/g和2.65nm。β-TCP较大的孔隙结构表面可见MSNs及BG涂布均匀、光滑,复合材料载药率高。结论:通过烧结与真空负压吸引等技术的成功合成了具有包封INH和RFP作用的/BG-MSN/β-TCP复合缓释材料,形貌特征均匀,比表面积良好,可以其可同时装载INH和RFP两种抗结核药物,载药量满意。实验第二部分:INH-RFP/BG-MSN/β-TCP复合缓释材料体内外缓释特性的检测目的:检测INH-RFP/BG-MSN/β-TCP复合缓释材料（CS-DDS）在体外和新西兰兔股骨体内的药物缓释特性,评价复合材料的缓释性能。方法:将一定量的CS-DDS放置到动态更换的SBF液中,取不同的时间点,用HPLC法检测其对应的药物浓度,总结CS-DDS在SBF液中的体外释放特性;将L-929细胞与CS-DDS材料共培养,MTT法检测其对L-929细胞活性的影响;将CS-DDS植入新西兰大白兔的股骨中下段骨缺损及骨髓腔内,分别于第1、3、5、7、14、28、42天取静脉血及肝、肾、脾和局部骨等组织,匀浆离心萃取后取上清液用HPLC检测对应INH和RFP的浓度,总结其体内释药特点;静脉血同时行ALT, AST, BUN及Cr值等肝肾功能指标检测,对照组用载药的β-TCP材料;取实验组第28、42d时的CS-DDS浸泡入SBF中,上清液（空白组用SBF缓冲液）与结核菌一起共同培养4周,观察记录结核菌生长情况。结论:CS-DDS无明显细胞毒性,体外有效释放可达30天,体内有效释放超过42天,其对应时间点的最终检测浓度都在对应药物的最低抑菌浓度（MIC）以上,未见明显肝、肾功能损害。该缓释材料缓释抗结核药物效果肯定,未见明显毒副作用。实验第三部分::INH-RFP/BG-MSN/β-TCP（CS-DDS）缓释复合体对兔桡骨缺损修复的实验研究。目的:评价BG-MSN复合后的β-TCP骨支架材料对兔桡骨骨缺损的修复性能。方法:建立兔桡骨骨缺损的实验动物模型,将定量的BG-MSN/β-TCP材料植入缺损部位,对照组用等量的β-TCP材料。术后16周取材,通过大体观察、影像学观察及组织学观察评价成骨修复情况。结果:肉眼观察BG-MSN/β-TCP充填的桡骨缺损处大量骨痂形成,缺损修复处较牢固,与单纯β-TCP组类似。X线片发现骨缺损处BG-MSN/β-TCP组与单纯β-TCP组成骨都较为明显,缺损处骨修复效果肯定。组织切片显示BG-MSN/β-TCP组骨缺损处有明显血管及成软骨细胞和成骨细胞长入,类似β-TCP组。结论:本实验通过物理的方法将BG-MSN加入复合到β-TCP内,形成的复合材料骨诱导成骨能力肯定,类似于β-TCP,说明其作为抗结核药物的缓释载体,在骨与关节结核行病灶清理术时,可以作为骨充填支架材料,具有良好的充填和诱导成骨能力。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 前言
• 一 骨与关节结核的现状
• 二 介孔二氧化硅（MSN）缓释载体
• 三 抗结核药物
• 四 β-TCP 人工骨支架材料
• 五 课题思路与研究内容
• （一） 课题思路
• （二） 研究内容
• 参考文献
• 实验第一部分：INH-RFP/BG-MSN-β-TCP的制备、结构组成表征及细胞毒性的研究
• 一 材料与方法
• （一） 材料
• （二） 方法
• （三） β-TCP、MSN 及CS-DDS 形貌特性检测
• 二 结果与讨论
• （一） MSNs 的形貌特征
• （二） 复合支架材料的形貌特征
• （三） 复合支架材料细胞毒性检测
• 三 本部分小结
• 参考文献
• 实验第一部分附图
• 实验第二部分：CS-DDS 体内外释放特性
• 一 材料与方法
• （一） 材料
• （二） 试验方法
• 二 结果
• （一） 体外释放SEM 像与EDS 波普像结果
• （二） CS-DDS 的INH 和RFP 的载药量
• （三） CS-DDS 的缓释结果
• （四） CS-DDS 在兔股骨体内的缓释特性
• （五） CS-DDS 局部植入对兔肝肾功能的影响
• （六） 体内缓释复合材料的抑菌试验
• 三 讨论
• 四 本部分小结
• 参考文献
• 实验第二部分附图
• 实验第三部分：BG-MSN-β-TCP 复合缓释骨支架材料促进兔桡骨骨缺损修复的实验研究
• 一 材料与方法
• （一） 材料
• （二） 方法
• 二 结果
• （一） 桡骨标本的大体观察
• （二） 桡骨修复后X 线片影像学评价
• （三） 桡骨修复后组织形态学观察
• 三 讨论
• （一） 兔桡骨骨缺损的动物模型
• （二） BG-MSN-β-TCP 的成骨性能
• 四 本部分小结
• 参考文献
• 实验第三部分附图
• 综述 抗结核药物缓释载体的研究现状
• 参考文献
• 在校期间主要科研活动和成果
• 致谢
• 文献检索查新证明