鱼腥蓝细菌PCC7120新型第二信使c-di-GMP功能的初步研究

论文摘要

环状双鸟苷酸（c-di-GMP）是一种新型的第二信使,在古菌和真核生物中不存在,为真细菌所特有。它能调控细菌的许多信号途径如细菌的运动性、生物膜、毒力等等。双鸟苷酸环化酶和磷酸二酯酶共同控制着胞内c-di-GMP的水平,其中双鸟苷酸环化酶中的保守结构域GGDEF合成c-di-GMP,而磷酸二酯酶中的保守结构域EAL或HD-GYP降解c-di-GMP。这些结构域经常与其他信号输入结构域相耦联,共同调控着细菌的各种生理活动。经在cyanobase数据库中的查找发现鱼腥蓝细菌PCC7120基因组中共有16个c-di-GMP相关的基因,涵盖调节c-di-GMP水平的三大结构域:GGDEF,EAL,HD-GYP。将这些GGDEF蛋白的氨基酸序列与已知的GGDEF蛋白PleD比对,发现14个蛋白中有11个蛋白与PleD蛋白的相似度超过30%,有9个具有变构调控功能的保守RXXD模体。而且,与这些结构域耦联的有RR,PAS等输入结构域。在原有6个中断失活载体情况下,本研究构建了9个用于构建缺失突变的载体,通过三亲本接合转移获得了2个缺失突变体,在缺氮条件下,与野生型无差异,但有一株表现出对钠盐敏感。同时,我们还构建了不同启动子融合的体内超表达菌株,其中已得到14个自身启动子融合和1个petE启动子融合的重组质粒,通过三亲本接合转移,获得了13个自身启动子融合的超表达菌株,其中有两株生长比野生型缓慢。本研究还构建了c-di-GMP相关基因的原核表达载体,现已得到12个载体,其中有7个在E.coli中获得了高效表达的融合蛋白,并成功纯化出2个蛋白,其大小与预期一致。在诱导大量表达过程中,E.coli发生聚集。以上结果为更深入地研究c-di-GMP提供了重要的材料和分子生物学基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1.前言
• 1.1 第二信使的研究进展
• 1.1.1 第二信使假说
• 1.1.2 第二信使种类
• 1.1.3 第二信使作用机制及生理意义
• 1.2 c-di-GMP研究进展
• 1.2.1 c-di-GMP的发现
• 1.2.2 c-di-GMP的生物合成及降解
• 1.2.3 GGDEF结构域和EAL结构域的特点
• 1.2.4 c-di-GMP与信号调控
• 1.3 蓝细菌背景介绍
• 1.3.1 鱼腥蓝细菌PCC7120简介
• 1.3.2 蓝细菌的接合转移
• 1.4 研究目的与意义
• 2 材料和方法
• 2.1 菌株和质粒
• 2.2 培养基配方以及培养条件
• 2.3 主要的分子生物学试剂
• 2.4 实验方法
• 2.4.1 鱼腥蓝细菌PCC7120基因组中c-di-GMP相关基因的查找与分析
• 2.4.2 大肠杆菌质粒DNA提取
• 2.4.3 质粒DNA的其它有关操作
• 2.4.4 蓝细菌总DNA的小量抽提
• 2.4.5 胞内c-di-GMP的提取
• 2.4.6 大肠杆菌转化
• 2.4.7 Anabaena PCC 7120通过三亲本杂交进行基因转移
• 2.4.8 蛋白质的表达和纯化
• 2.4.9 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 3 结果与分析
• 3.1 鱼腥蓝细菌PCC7120基因组中c-di-GMP相关基因的查找与分析
• 3.1.1 GGDEF、EAL和HD-GYP结构域
• 3.1.2 RXXD模体的查找
• 3.1.3 与GGDEF、EAL或HD-GYP结构域耦联的其他结构域
• 3.2 c-di-GMP相关基因缺失突变体的构建
• 3.2.1 引物设计
• 3.2.2 基因缺失结构的构建
• 3.2.3 缺失突变体的筛选
• 3.2.4 缺失突变体的验证
• 3.2.5 突变体的表型
• 3.3 c-di-GMP相关基因在鱼腥蓝细菌PCC7120中的超表达
• 3.3.1 超表达质粒的构建
• 3.3.2 超表达菌株构建及验证
• 3.3.3 超表达菌株表型观察
• 3.4 重组蛋白的表达
• 3.4.1 重组融合质粒的构建
• 3.4.2 重组蛋白的表达及表型
• 3.4.3 重组蛋白的纯化
• 4.小结与讨论
• 参考文献
• 致谢
• 附录1 鱼腥蓝细菌PCC7120中c-di-GMP相关蛋白的结构域
• 附录2 本研究所需引物
• 附录3 质粒及菌株构建完成情况简表