论文摘要
一、β-连环蛋白在TNF-α和Fas诱导急性肝损伤中的双重作用机制研究研究背景和目的急性肝功能衰竭是一种常见的临床危重症,常导致多器官功能衰竭,在全世界范围内有极高的致死率。临床上对于急性肝损伤的治疗缺乏特异性治疗手段,预后不理想。尽管原位肝移植是目前治疗急性肝损伤的最有效手段,但是由于供肝来源短缺、手术风险高、费用昂贵,且术后需长期服用免疫抑制剂,也导致大部分患者无法接受肝移植治疗。急性肝衰竭的发生机制主要包括毒性物质直接损伤细胞器引发细胞凋亡导致原发性肝损伤,以及肝毒性物质刺激免疫系统活化引起继发性肝损伤。因此,通过减轻细胞凋亡可作为治疗急性肝损伤的新途径。脂多糖（LPS）和D-半乳糖胺（GalN）联合使用广泛用于诱发小鼠急性肝损伤模型。TNF-α是在GalN/LPS模型中导致肝细胞凋亡的最重要因子。Fas诱导的肝细胞凋亡在免疫介导的肝脏疾病中起重要作用,Fas抗原在肝细胞内高表达,因而肝细胞对Fas诱导的肝损伤十分敏感。给予小鼠注射抗Fas抗体（Jo2）会产生致死性肝损伤。β-连环蛋白（β-Catenin）是经典Wnt信号通路中的关键蛋白,调节调节细胞的生长、增殖、分化以及凋亡。Wnt/β-Catenin信号通路的异常改变,尤其是β-Catenin的持续活化在多种肿瘤中都有发生,包括原发性肝癌。β-Catenin对细胞凋亡的调节作用十分复杂,在本研究室前期工作中发现,肝细胞特异性敲除β-Catenin小鼠对GalN/LPS诱导的肝损伤敏感性降低,而对Jo2诱导的肝损伤反应加重。β-Catenin在两种肝毒性药物诱导肝损伤过程中发挥双重作用的机制还不清楚。本课题研究将利用肝细胞特异性β-Catenin敲除小鼠以及过表达β-Catenin的 Hepal6细胞系从体内外两方面对β-Catenin在急性肝损伤中的作用进行再一步验证,并探讨其发挥双重作用的机制。材料和方法1.繁育肝细胞特异性敲除β-Catenin小鼠,小鼠的基因表型通过PCR验证；2.分别通过腹腔注射GalN/LPS和Jo2,建立小鼠肝损伤模型,处理6hr后收集肝脏标本；3.使用TUNEL法检测肝细胞凋亡,Western blot检测肝细胞凋亡相关蛋白PARP和Caspase3;4.应用si-RNA技术沉默Hepal-6细胞中β-Catenin表达,沉默效率通过qRT-PCR和western blot检测。应用CCK-8检测沉默β-Catenin后细胞对TNF-α和Jo2的细胞毒性作用；5.应用免疫组化方法检测肝组织p65核转位,报告基因检测Hepal-6细胞中NF-κB转录活性；6.应用qRT-PCR方法检钡NF-κB下游靶基因SOD2和A20表达；7.应用免疫共沉淀方法检测β-Catenin和p65结合程度；8.含突变β-Catenin的腺病毒S37A用于感染Hepal-6细胞,建立过表达β-Catenin的Hepal-6细胞。过表达效率通过western blot,报告基因和qRT-PCI检测；9.细胞免疫荧光检测过表达β-Catenin后p65核转位情况；10.应用MDA试剂盒检测过表达β-Catenin后Hepal-6对TNF-α诱导的氧化应激的作用；11.qRT-PCR和Western blot检测肝组织中Fas的表达情况。12.应用GraphPad Prism5.0统计软件对结果进行统计分析。结果1.肝细胞特异性敲除β-Catenin减轻GralN/LPS诱导的肝细胞凋亡。Hepal-6细胞干扰β-Catenin表达后TNF-α诱导的肝细胞死亡减少,而过表达β-Catenin后肝细胞死亡增多。2.β-Catenin通过与NF-κB结合,影响NF-K B的转录活性。受GalN/LPS刺激后,肝细胞特异性敲除β-Catenin小鼠肝细胞中p65入核增加,下游靶基因A20和SOD2表达增加。Hepal-6细胞过表达β-Catenin后p65入核减少。3.肝细胞特异性敲除β-Catenin通过NF-κB加重GalN/LPS诱导的氧化应激反应。Hepal-6细胞过表达β-Catenin后TNF-α诱导的氧化应激减弱。4.β-Catenin与NF-κB结合影响Fas表达。肝细胞特异性敲除β-Catenin小鼠肝细胞Fas表达增加,肝脏对Jo2刺激的敏感性增加,肝损伤加重,细胞凋亡增加。结论本研究从动物和细胞水平证明β-Catenin在TNF-α和Fas所致的急性肝损伤中起不同作用。β-Catenin能够加重由TNF-α诱导的肝细胞凋亡,这主要是通过β-Catenin同NF-κB结合,抑制了其转录活性所致。此外,β-Cater in还可加重TNF-α诱导的氧化应激。由于Fas的表达也受NF-K B调控,肝细胞特异性敲除β-Catenin小鼠Fas表达增高,因而加重了Jo2诱导的肝损伤。β-Catenin通过与NF-κB的相互作用调节TNF-α和Fas诱导的急性肝损伤。二、肝内胆管细胞癌外显子组单核苷酸多态性及插入缺失的检测研究背景和目的肝内胆管细胞癌（][ntrahepatic cholangiocarcinoma, ICC）是起源于外周（肝内）胆管上皮细胞的恶性肿瘤,是继肝细胞癌之后最常见的原发性肝脏恶性肿瘤。由于缺乏特异的早期诊断分子标志物,影像学特征不典型,因此早期诊断困难。且ICC淋巴结转移较早,因此诊断时患者多属进展期,从确诊至患者死亡的时间很短。如今疾病谱已悄然发生变化,ICC的发病率与死亡率正在逐渐增加。逐渐增加的发病率结合ICC高度恶性的生物学特征,使ICC迫切需要广大医务工作者以及研究人员的关注。外显子组（Exome）是人类基因组全部外显子的总称,其作为蛋白质的编码区,与人类约85%的致病突变相关。外显子组测序以其高通量、价格低廉的优势,在近年来在肿瘤基因组的研究中得到了广泛的应用。通过外显子组测序能够检测蛋白质编码区内的突变,通过预测突变对蛋白质功能的影响,寻找致癌突变。本课题通过对8例ICC基因组及对照组织基因组进行外显子组测序,寻找与ICC发生有关的单核苷酸多态性和短插入缺失突变,为寻找ICC的致病基因提供方向。材料和方法1.收集8例经病理诊断明确的肝内胆管细胞癌手术切除标本,包括肿瘤组织、癌旁组织和远端正常肝组织。2.应用QIAamp DNA Mini Kit抽提肝组织基因组,用Roche NimbleGen V2 exomekit捕获外显子。3.外显子测序应用Illumina Solexa Hiseq2000平台进行,采取双末端（2×100bp）策略,测序深度为45倍。4.测序结果使用FastQC进行质量监控,BWA进行将序列比对到人类基因组参考序列（GRCh37.63）上,SAMtools对比对序列进一步筛选。5.突变通过、arScan检测,随后编写Perl程序对突变结果进行筛查。6.排除种系突变和已在dbSNP和1000Genome Project中报道的已知突变。7.应用CooVar预测突变对氨基酸编码的影响。8.筛选至少在两例ICC中出现突变的基因,作为ICC相关的候选基因。结果1. FastQC质量检测显示来自所有样本的序列质量均通过了质量筛查。2.通过BWA序列比对和SAMtools筛选,约70%的序列匹配到人类基因组参考序列上。编码区平均序列覆盖深度达到47.2倍,约90.4%的编码区序列覆盖率至少达到10倍。3.经突变检测、质量筛选和功能预测,共2550个突变对氨基酸编码产生影响。23个基因在至少两例ICC中存在突变。结论本试验应用外显子组测序的方法对来自8例ICC患者的24例标本进行了测序,首次对ICC外显子组的单核苷酸多态性和插入缺失进行了检测。共发现了23个基因,其突变可能与ICC有关。