体外循环对神经细胞损伤和神经节苷脂的脑保护作用及机制

论文摘要

近年来,虽然随着医疗设备与技术的不断进步,心脏外科总的死亡率和并发症在持续下降,但术后神经并发症的发生率却基本无变化,明显的和亚临床的围手术期脑损伤依然是一个未解决的问题。而目前对体外循环（CPB）相关的脑病理生理变化和脑的并发症的发生机制仍缺乏深入的了解,对神经系统并发症仍缺乏有效的治疗和预防措施,因此CPB的脑损伤和脑保护一直是人们研究的热点。本研究以SD大鼠为实验动物,经颈静脉引流,尾动脉灌注,成功建立了经济、预充量小、可靠、重复性好的小动物CPB模型,从形态功能学、分子生物学等方面对CPB对神经细胞损伤和单唾液酸神经节苷脂（GM1）的脑保护作用及机制研究进行了探讨。同时在临床上,通过研究GM1对老年患者CPB下心脏手术围术中S100B、Tau蛋白的变化及对脑氧代谢的影响,探讨GM1是否具有脑保护作用及可能机制。（一）大鼠CPB模型的建立选用成年健康雄性SPF级SD大鼠,利用特制微型动物膜式氧合器,经右颈静脉插管引流,尾动脉插管灌注建立小预充量的CPB,转流时间l h,股动脉插管监测血流动力学指标及血气、电解质的变化。结果显示,90%大鼠顺利建立CPB模型,CPB期间血流动力学稳定,动脉血气及电解质指标正常,基本达到理想的CPB标准。停机后呼吸和心血管循环功能顺利恢复,获得了24小时的较长时间生存。本方法建立的大鼠CPB模型切实可行,具有简单实用、重复性好的特点,是进行CPB相关性脏器损伤,尤其是脑损伤机制研究可靠的实验平台。（二）形态功能学的动物基础研究成年健康雄性SPF级SD大鼠随机分为CPB组、CPB+GM1组、输血组和假手术组。建立大鼠CPB模型,在预充液中加入GM1 20 mg/kg。24 h后取脑组织进行检测。（1）采用透射电镜技术观测海马和皮层的超微结构,以探讨GM1对CPB脑损伤的保护作用。结果示,CPB后神经细胞出现粗面内质网和游离核糖体明显减少,线粒体肿胀,空泡化,嵴断裂,溶解,消失,细胞膜崩解;神经丝模糊、突触间隙模糊不清,出现较多神经细胞凋亡。GM1干预后神经细胞的超微结构轻度改善,突触间隙增宽,凋亡细胞减少。（2）研究CPB后脑组织的氧化应激反应的变化及GM1干预后对其的影响。结果显示,CPB后脑组织中,乳酸脱氢酶由正常的38.21±3.61（U/mg）增加到62.17±6.71（P<0.01）,给予GM1后下降到51.63±5.92（P<0.05）,与CPB组比较有显著差异（P<0.05）;MDA由正常的2.14±0.81（nmol/mg）升高到6.76±1.31（P<0.01）,给予GM1后下降到4.53±0.93（P<0.05）,与CPB组比较有显著差异（P<0.05）;而SOD、GSH-Px的活性分别由正常的1173.72±268.75、128.32±42.74（mmol/h/mg）降低到586.74±133.46、73.19±18.67（P<0.01）,给予GM1后分别回升到723.19±189.65、89.41±22.16,与CPB组比较有显著差异（P<0.05）。提示CPB脑损伤的过程中氧自由基是重要的致病因素,GM1可以明显减少氧自由基的产生和促进SOD、GSH-Px的产生。（3）观察CPB后脑组织的的Na+-K+-ATP酶活性变化及神经节苷脂干预后对其的影响。结果显示,CPB组脑组织中的Na+-K+-ATP酶活性由正常的17.03±4.17（mol·Pi/g·protein/h）下降到12.45±2.64（P<0.01）,CPB+GM1组下降到14.72±3.29（P<0.05）,与CPB组比较有显著差异（P<0.05）。提示CPB可抑制Na+-K+-ATP酶活性,GM1可起到稳定细胞膜Na+-K+-ATP酶的作用。（4）研究CPB后脑组织的NOS活性的变化及GM1干预后对其的影响。结果显示,CPB组脑组织中的iNOS活性由正常的16.47±2.52（pmol/mg/prot/min）增加到69.84±8.73（P<0.01）,CPB+GM1组则增加到57.86±7.79（P<0.01）,与CPB组比较有显著差异（P<0.05）;CPB组脑组织中的cNOS活性由正常的57.74±8.78（pmol/mg/prot/min）下降到32.67±6.61（P<0.01）,CPB+GM1组则下降到42.72±7.23（P<0.05）,与CPB组比较有显著差异（P<0.05）;CPB组脑组织中的NO含量由正常的258.91±48.17（pmol/mg·prot）增加到713.74±98.43（P<0.01）,CPB+GM1组则增加到523.74±87.36（P<0.01）,与CPB组比较有显著差异（P<0.05）。提示CPB脑损伤与iNOS产生大量的NO导致的神经毒性作用有关;GM1在一定程度降低了脑中活化的iNOS含量,减少了NO的分泌释放,具有一定的脑保护作用。（5）基于分子生物学及酶联免疫吸附测定技术,研究CPB后海马、皮层炎性因子表达的变化及GM1干预后对其的影响。结果显示,海马、皮层TNF-α、IL-1β、ICAM-1和IL-10 mRNA表达在假手术组和输血组的表达水平低,两组间差异无显著性（P>0.05）;在CPB组和CPB+GM1组,海马、皮层TNF-α、IL-1β、ICAM-1和IL-10 mRNA表达水平均明显增加（P<0.05或P<0.01）,同时海马的表达量较皮层的表达量更明显（P<0.05）,但两组间差异无显著性（P>0.05）。可见,CPB可诱导海马、皮层TNF-α、ICAM-1、IL-1β、IL-10 mRNA表达,导致相应的细胞因子蛋白分泌增加,从而启动了炎症反应途径,引起脑损伤,尤其以海马损伤更明显。GM1不影响脑组织TNF-α、ICAM-1、IL-1β、IL-10 mRNA表达,不能导致相应的细胞因子蛋白分泌减少;GM1的脑保护作用不是通过抑制炎症反应的途径来起作用的。（三）临床研究观察研究GM1对老年患者CPB心脏手术围手术期中S100B、Tau蛋白的变化及对脑氧代谢的影响,从而探讨其是否具有脑保护作用及可能机制。择期在CPB下行主动脉瓣和/或二尖瓣置换术的患者40例,年龄>60岁,随机分为对照组和GM1组,每组20例。分别于转机前（T0）、主动脉阻断后5分钟（T1）、主动脉开放后5分钟（T2）、停机后即刻（T3）、停机后60分钟（T4）、停机后24 h（T5）测颈内静脉球部、桡动脉血气,计算出脑氧供和氧耗比值（CBF/CMRO2）及脑氧耗和脑糖耗比值（CMRO2/CMRGLU）。用ELISA法测定颈内静脉球部血清中S100B、Tau蛋白水平。结果显示,GM1组在T1、T2、T3、T4、T5与对照组相比,血清S100B、Tau蛋白的浓度均下降并有统计学明显差异（P>0.05）。SjvO2变化:与T0比较,T1时两组均升高,T2、T3、T4下降,停机24h恢复正常;组间比较,对照组于T2、T3、T4下降较GM1组明显（P<0.05）。CBF/CMRO2变化:与T0比较,T1时两组均升高,T2、T3、T4下降,停机24h恢复正常;组间比较,T2、T3、T4下降较GM1组明显（P<0.05）。CMRO2/CMRGLU变化:与T0比较,T1时两组均升高,T2、T3、T4下降,停机24h恢复正常;组间比较,对照组于T2、T3、T4下降较GM1组明显（P<0.05）。提示老年患者CPB术后S100B、Tau蛋白释放明显增加,CPB可导致脑氧代谢的过程性失衡,标记反映老年患者CPB后的脑损伤;GM1可以减少S100B、Tau蛋白的表达分泌,能够更好地维持CPB过程中的脑氧供需平衡,起到一定的脑保护作用。综上所述,动物实验和临床检测均显示CPB可导致一定程度的脑损伤,CPB脑损伤的机制与氧化应激、抑制Na+-K+-ATP酶活性、iNOS介导的NO神经毒性作用以及炎症反应、脑氧供需过程性失衡有关。GM1通过减轻CPB导致的神经细胞形态学改变,抑制氧化应激和iNOS,提高Na+-K+-ATP酶活性,稳定脑氧供需平衡而起到一定的脑保护作用。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 实验部分
• 第一部分 大鼠CPB 模型的建立
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 4. 小结
• 参考文献
• 第二部分 GM1 对大鼠CPB 脑损伤的保护作用—形态、功能研究
• 1对CPB 后大鼠海马、皮层细胞超微结构的影响'>实验一 GM₁对CPB 后大鼠海马、皮层细胞超微结构的影响
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 4. 小结
• 参考文献
• 1对CPB 后大鼠脑组织氧化性应激的影响'>实验二 GM₁对CPB 后大鼠脑组织氧化性应激的影响
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 4. 小结
• 参考文献
• +-K⁺-ATPase 活性的影响'>实验三 GM)1对CPB 后大鼠脑组织Na⁺-K⁺-ATPase 活性的影响
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 4. 小结
• 参考文献
• 1对CPB 后大鼠脑组织一氧化氮合成酶活性的影响'>实验四 GM₁对CPB 后大鼠脑组织一氧化氮合成酶活性的影响
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 4. 小结
• 参考文献
• 1 对CPB 后大鼠海马、皮层炎性细胞因子的影响'>实验五 GM₁ 对CPB 后大鼠海马、皮层炎性细胞因子的影响
• 1. 材料与方法
• 2. 实验结果
• 3. 讨论
• 4. 小结
• 参考文献
• 1对CPB 心内直视术老年患者S100B、Tau 蛋白水平及脑氧代谢的影响'>第三部分 GM₁对CPB 心内直视术老年患者S100B、Tau 蛋白水平及脑氧代谢的影响
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 4. 小结
• 参考文献
• 全文总结
• 创新和意义
• CPB 脑损伤及发生机制（综述）
• 致谢（Acknowledgements）
• 攻读博士学位期间发表的论文目录