拟南芥MIR396家族对靶基因的调控及对根发育的影响

论文摘要

MicroRNAs （miRNAs）是真核生物基因组中一类长度在19-24nt的,依赖序列特异性的基础的调控分子,它们可以在转录后水平介导基因沉默。在真核生物中比niRNA更加广泛存在的是siRNA,它们不仅可以介导转录后沉默,还可以介导转录水平的基因沉默。在拟南芥中,miR396家族包含miR396a和miR396b,它们分别由两个不同的基因MIR396a和MIR396b编码。GRF （growth-regulating factors）是由9个同源基因构成的一个转录因子家族,其中GRF1, GRF2, GRF3, GRF4, GRF7,GRF8和GRF9是miRNA396的靶基因,GRF通过控制细胞的分裂（数目）而对叶片的发育起作用。miR396通过对GRF进行转录后水平的抑制,控制GRF的表达部位,参与对叶片发育的调控。本研究中,为了探索miR396在拟南芥发育中的生物学功能,通过构建35S:MIR396a和35S:MIR396b载体,获得了过量表达MIR396a和MIR396b转基因拟南芥株系。35S:MIR396a和35S:MIR396b转基因株系都出现了叶片明显小于野生型的表型。除了叶表型外,35S:MIR396a根长明显短于野生型,显微观察发现35S:MIR396a分生区结构明显异于野生型,而35S:MIR396b根长与野生型无明显的差异。通过对MIR396a和MIR396b及GRF的启动子报告基因株系的GUS染色,我们发现MIR396和GRF在根部都有明显的表达。根据MIR396与GRF的表达部位,我们推测MIR396对同一家族不同GRF成员有不同的调控模式。35S:MIR396a、35S:MIR396b转基因株系及野生型根部GRF表达量分析证实了miR396能下调GRF转录本水平。由于grf突变体都未出现根表型异常,说明miR396对GRF的调控作用并非短根表型出现的原因。miR396a与miR396b只有一个碱基的差异存在于3’末端,而这种差异一般认为不会对它们靶基因的选择及降解作用产生影响,因而我们推测35S:MIR396a和35S:MIR396b转基因株系根表型的不同可能与MIR396茎环部分有关。通过miR396a和miR396b成熟体的互换,我们构建了35S:preMIR396a-b （MIR396a茎环接上miR396b成熟体）,35S:preMIR396b-a （MIR396b茎环接上miR396a成熟序列）转基因株系。发现绝大多数35S:preMIR396a-b都表现出根发育情况类似于35S:MIR369a,而35S:preMIR396b-a转基因株系根表型与野生型无差异。该结果表明MIR396a茎环部分可能是短根表型出现的重要原因,也证实了MIR396a过量表达会导致短根表型的出现。最近的研究发现,许多经典的MIR基因可以产生siRNA,对sRNA的深度测序表明这类sRNA与经典的miRNA一般只有左右几个碱基的摇摆。据此,我们在small RNA数据库中搜索MIR396a相关的miRNA及siRNA,并利用psRNATarget软件预测其可能的靶基因,结果发现了一个来源于MIR396a与miR396序列相近的小RNA（sRNA14117）,与AT1G10120可以进行很好的配对。5’RACE实验表明,AT1G10120与sRA14117/miR396在配对位点（相对于sRNA141175’端第13个碱基,相对于miR3965’端第10个碱基）发生剪切,因而证实了AT1G10120是MIR396一个新的靶基因。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 前言
• 1 植物microRNA和siRNA生成途径
• 1.1 PolⅡ转录产生pri-miRNA
• *双链'>1.2 pri-miRNA经过DCL的两步剪切形成miRNA-miRNA^*双链
• 1.3 miRNA和siRNA被HEN1甲基化
• 1.4 miRNA与AGO1及其它蛋白结合生成miRISC
• 1.5 MIR基因可产生siRNA
• 2. AtmiR396及其靶基因AtGRF研究进展
• 2.1 AtmiR396基本概况
• 2.2 GRF功能研究介绍
• 2.3 miR396通过对GRF的调控控制叶片的发育
• 3 本研究的提出
• 第二章 AtMIR396对靶基因的调控及其对根发育的影响
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 试剂和主要仪器
• 1.3 拟南芥的培养
• 1.4 基因克隆和载体构建
• 1.5 拟南芥转基因及筛选
• 1.6 植物RNA提取
• 1.7 Small RNA Northern Blot
• 1.8 qRT-PCR
• 1.9 GUS蛋白的组织化学染色
• 2 实验结果
• 2.1 35S:MIR 396a. 35S:MIR396b拟南芥转基因株系的获得及分子鉴定
• 2.2 35S:MIR 396a、35S：MIR396b拟南芥转基因株系表型的观察
• 2.3 35S:MIR396a转基因株系根分生区异常
• 2.4 AtMIR396a,AtMIR396b及其靶基因GRF在根部的表达模式
• 2.5 AtMIR396a、AtMIR396b过量表达对靶基因的作用效率不同
• 2.6 grf突变体根长与野生型无差异
• 2.7 MIR396a新的靶基因的预测及验证
• 2.8 35S:preMIR396a-b与35S:preMIR396b-a转基因株系的获得及分子鉴定
• 2.9 35S:preMIR 396a-b出现短根表型
• 3 讨论
• 3.1 GRF对拟南芥根发育的影响
• 3.2 MIR396a和MIR396b对靶基因下调的效率不同可能与siRNA有关
• 3.3 MIR396对靶基因AT1G10120的调控作用可能通过miRNA或者siRNA途径实现
• 3.4 MIR396a造成拟南芥短根表型与其茎环序列有关
• 3.5 总结与展望
• 参考文献
• 致谢