重组人ADAM15去整合素结构域蛋白的制备及其作用机理

论文摘要

ADAM （A Disintegrin And Metalloproteinase）是一类含有七个功能结构域并在细胞间相互识别和相互作用中发挥重要作用的跨膜糖蛋白家族。ADAM15作为该家族唯一在去整合素结构域（disintegrin）含有RGD（Arg-Gly-Asp）基序的成员,在细胞外基质降解、细胞粘附、细胞内信号转导和肿瘤的病理变化等过程中发挥重要作用,但是其抗肿瘤机理需进一步阐释。本文在成功获取高表达水平的重组人ADAM15去整合素结构域蛋白片段（rhddADAM15）的基础上,以小鼠黑色素瘤细胞（B16）为研究模型,研究rhddADAM15对B16细胞体外增殖、粘附和迁移等细胞行为的影响,通过筛选rhddADAM15特异结合的12肽以及rhddADAM15在B16细胞上相互作用的靶点蛋白,探讨rhddADAM15干预肿瘤细胞行为的生理机制。主要研究结果如下:1)为获得大量具有生物活性的rhddADAM15蛋白,在详尽分析目标蛋白的cDNA序列的基础上,（1）选择能为大肠杆菌稀有密码子提供额外tRNA的大肠杆菌Escherichia coli Rosetta（DE3）作为宿主菌,将目标蛋白以GST（Glutathione-S-transferase）融合蛋白形式表达,在最佳诱导表达条件下融合蛋白GST-ADAM15浓度为298 mg/L,最佳凝血酶酶切条件下,rhddADAM15浓度为42 mg/L; （2）采用PCR体外定点突变技术将凝血酶识别序列附近稀有密码子GGA（Gly）替换为GGC,同时消除Pro-Glu-Phe残基,构建突变表达质粒,提高凝血酶酶切效率。在相同的表达和酶切条件下获得GST-△-ADAM15和rhddADAM15蛋白浓度分别为326 mg/L和68mg/L,比野生型分别提高9.4%和61.9%。这一结果表明,在充分认识目标蛋白特性的基础上定向选择表达宿主并改造表达质粒能实现外源蛋白高水平表达;2)采用MTT法测定rhddADAM15对B16、MCF-7/W以及HMEC-1细胞体外增殖的作用,采用创伤愈合实验、Matrigel基质胶以及Transwell侵袭小室法观察rhddADAM15对B16细胞体外迁移、粘附和侵袭的影响;采用台盼蓝染色法分析细胞活力、流式细胞仪检测rhddADAM15对B16细胞周期的影响。结果表明rhddADAM15对肿瘤细胞和正常内皮细胞生长均有一定的抑制作用（其IC50分别为9.5、11.8和14.9μg/mL）,且明显抑制B16细胞的体外增殖、迁移、粘附和侵袭。台盼蓝染色法表明低剂量的rhddADAM15并不能导致B16细胞出现坏死,且rhddADAM15并不导致B16细胞出现典型的凋亡峰,而是将细胞阻滞于G2/ M期,并且这种作用呈剂量依赖关系;3)采用亲和甄别磁珠技术筛选rhddADAM15在B16细胞上的结合蛋白。将rhddADAM15采用蛋白生物素化方法标记生物素,借助生物素-亲和素系统,将生物素化的rhddADAM15固定于亲和素标记的免疫磁珠。从B16细胞裂解液中钓出与之相互作用的蛋白,经浓缩富集后,采用双向电泳分离技术分离获得主要的结合蛋白点,然后对这些蛋白点进行电喷雾串联质谱技术（ESI-MS）分析,在蛋白数据库中检索,共鉴定了8个蛋白质,按功能可分为如下三类:（1）临床应用的肿瘤标志物（苹果酸脱氢酶、磷酸甘油醛脱氢酶和谷氨酸脱氢酶）;（2）能量代谢相关蛋白（烯醇酶、磷酸丙糖异构酶、原肌球蛋白和血红蛋白）;（3）信号转导通路成员（p38MAPK激酶）等。在此基础上通过分子对接软件molsoft ICM模拟计算获得rhddADAM15与p38激酶相互作用的最佳模式和重要的结合位点;4)采用噬菌体展示技术筛选与rhddADAM15特异性相互作用的多肽序列。采用噬菌体随机十二肽库对固定有rhddADAM15的亲和磁珠系统进行生物淘洗,获得4条与rhddADAM15特异结合的12肽。将获得的12肽与蛋白质库进行序列比对,发现细胞周期相关蛋白如Cdc25和p53,信号通路相关蛋白/受体,如整合素αvβ3的胞外区,丝裂原活化蛋白激酶p38α等与所获得的4条12肽具有高度同源性;5)基于上述研究所获得的rhddADAM15在B16细胞上潜在的靶点蛋白,进一步研究rhddADAM15与p38MAPK激酶的体外相互作用,结合rhddADAM15对B16细胞行为的抑制作用,采用蛋白点杂交和激酶活性测定方法分析rhddADAM15在体外与重组p38激酶蛋白的结合情况,同时研究不同剂量rhddADAM15对B16细胞中p38MAPK激酶磷酸化水平的影响,并观察rhddADAM15对p38激酶活性受到部分抑制的B16细胞的增殖和细胞周期抑制作用的变化。发现:（1）rhddADAM15在离体低温条件下能够和重组p38激酶蛋白结合,但rhddADAM15（0-10μg/mL）在体外对p38MAPK激酶活性没有影响;（2）同样剂量的rhddADAM15作用于B16细胞24 h后,细胞中p38MAPK激酶的磷酸化水平提高（被激活）;（3）p38激酶的特异性抑制剂SB203580（0.5 mmol/L）预处理B16细胞30 min后,rhddADAM15对细胞增殖的抑制作用减弱（IC50由未经处理的9.5μg/mL增加到11.4μg/mL）,对细胞周期的阻滞作用也减弱（G2/M期细胞比率从未经处理的的28.77%降到16.59%）。上述结果表明,p38MAPK信号转导通路参与了rhddADAM15对B16细胞增殖和细胞周期的抑制作用,同时也表明生理条件下rhddADAM15与p38MAPK激酶相互作用的复杂性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 概述
• 1.2 ADAM 家族蛋白的国内外研究进展
• 1.2.1 ADAM 家族的结构特点和生物功能
• 1.2.2 ADAM 家族与肿瘤发生的相关性
• 1.2.3 ADAM 家族蛋白的作用机制
• 1.2.4 ADAM 家族蛋白的重组表达
• 1.2.5 ADAM15 的研究概述
• 1.3 本论文的主要研究内容
• 1.3.1 ADAM15 研究中存在问题
• 1.3.2 本研究的主要内容
• 第二章 重组人ADAM15 去整合素结构域蛋白的制备
• 2.1 前言
• 2.2 实验材料、仪器
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 实验仪器
• 2.3 实验方法
• 2 法制备感受态细胞'>2.3.1 CaCl₂法制备感受态细胞
• 2.3.2 PCR 扩增目的基因
• 2.3.3 表达质粒pGEX-ADAM15 的构建
• 2.3.4 突变表达质粒pGEX-Δ-ADAM15 的构建
• 2.3.5 融合蛋白GST-ADAM15 的诱导表达和纯化
• 2.3.6 融合蛋白GST-ADAM15 的表达条件优化
• 2.3.7 融合蛋白GST-ADAM15 的制备
• 2.3.8 rhddADAM15 蛋白的纯化和鉴定
• 2.4 结果
• 2.4.1 ADAM15 去整合素cDNA 的密码子分析及其在E. coli BL 21 中表达
• 2.4.2 pGEX-ADAM15 在E. coli Rosetta（DE3）中表达和条件优化
• 2.4.3 pGEX-Δ-ADAM15 在E. coli Rosetta（DE3）中表达
• 2.4.4 融合蛋白GST-ADAM15 的凝血酶消化
• 2.4.5 rhddADAM15 的鉴定
• 2.5 讨论
• 2.6 小结
• 第三章 rhddADAM15 对黑色素瘤细胞作用的研究
• 3.1 前言
• 3.2 实验材料、仪器
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 细胞培养
• 3.3.2 MTT 法测定rhddADAM15 对细胞增殖的抑制
• 3.3.3 细胞粘附试验
• 3.3.4 细胞迁移试验
• 3.3.5 细胞侵袭试验
• 3.3.6 rhddADAM15 对细胞周期分布的影响
• 3.4 实验结果
• 3.4.1 rhddADAM15 抑制肿瘤细胞及内皮细胞的生长
• 3.4.2 rhddADAM15 抑制 B16 细胞的粘附
• 3.4.3 rhddADAM15 抑制 B16 细胞的迁移和侵袭
• 3.4.4 rhddADAM15 对 B16 细胞活力的影响
• 3.4.5 rhddADAM15 对 B16 的细胞周期的影响
• 3.5 讨论
• 3.6 小结
• 第四章 筛选 rhddADAM15 与黑色素瘤细胞作用的靶点蛋白质
• 4.1 前言
• 4.2 实验材料、仪器
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 实验仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 流式细胞术（FCM）检测 rhddADAM15 与 B16 细胞的结合
• 4.3.2 制备黑色素瘤细胞（B16）裂解蛋白质
• 4.3.3 Western 杂交检测 rhddADAM15 与 B16 全细胞蛋白的结合
• 4.3.4 亲和甄别磁珠筛选rhddADAM15 结合蛋白质
• 4.3.5 电泳分析rhddADAM15 的结合蛋白质
• 4.3.6 电喷雾串联质谱（ESI-MS/MS）测序
• 4.3.7 rhddADAM15 与其结合蛋白质的相互作用模式研究
• 4.4 实验结果
• 4.4.1 流式细胞术（FCM）
• 4.4.2 Western 杂交检测 rhddADAM15 与 B16 全细胞蛋白的结合
• 4.4.3 SDS-PAGE 分析rhddADAM15 的结合蛋白
• 4.4.4 2DE 分析rhddADAM15 的结合蛋白
• 4.4.5 特异结合蛋白质点的质谱（LC-ESI-MS/MS）鉴定
• 4.4.6 rhddADAM15 与p38 激酶的相互作用模式研究
• 4.5 讨论
• 4.6 小结
• 第五章 噬菌体展示技术分析 rhddADAM15 的结合肽
• 5.1 前言
• 5.2 实验材料、仪器
• 5.2.1 实验材料、试剂
• 5.2.2 主要溶液配制方法
• 5.2.3 实验仪器
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 生物素化rhddADAM15 的制备
• 5.3.2 生物素化rhddADAM15 的检测
• 5.3.3 噬菌体随机肽库淘洗rhddADAM15 的结合肽
• 5.3.4 滴度测定（梯度稀释法）
• 5.3.5 噬菌体单克隆的挑选与扩增
• 5.3.6 噬菌体DNA 的抽提和序列测定
• 5.3.7 ELISA 方法鉴定淘洗得到的噬菌体单克隆的阳性率
• 5.4 实验结果
• 5.4.1 b-rhddADAM15 紫外扫描图谱分析
• 5.4.2 b-rhddADAM15 的ELISA 法检测
• 5.4.3 噬菌体随机肽库对生物素化rhddADAM15 的淘选结果
• 5.4.4 噬菌体DNA 的抽提以及插入序列的测序
• 5.4.5 十二肽序列分析
• 5.4.6 ELISA 验证噬菌体单克隆与rhddADAM15 的结合状况
• 5.4.7 十二肽序列在蛋白质数据中的比对分析（BLAST）
• 5.5 讨论
• 5.6 小结
• 第六章 rhddADAM15 靶点蛋白的验证
• 6.1 前言
• 6.2 实验材料、仪器
• 6.3 实验方法
• 6.3.1 离体下检测rhddADAM15 与p38 激酶的相互作用
• 6.3.2 rhddADAM15 作用后 B16 细胞 p38 激酶活性测定
• 6.3.3 免疫细胞化学法检测 rhddADAM15 在 B16 胞内的分布
• 6.3.4 SB203580 干预下 rhddADAM15 对 B16 细胞增殖的作用
• 6.3.5 SB203580 干预下 rhddADAM15 对 B16 细胞周期的作用
• 6.4 实验结果
• 6.4.1 离体条件下rhddADAM15 与重组p38 激酶结合的点杂交检测
• 6.4.2 离体条件下rhddADAM15 对p38 激酶活性的影响
• 6.4.3 rhddADAM15 在 B16 细胞内的分布
• 6.4.4 rhddADAM15 对 B16 细胞中 p38 激酶活性的影响
• 6.4.5 SB203580 对 rhddADAM15 抑制 B16 细胞增殖的影响
• 6.4.6 SB203580 对 rhddADAM15 作用下 B16 细胞周期的影响
• 6.5 讨论
• 6.6 小结
• 主要结论
• 论文创新点
• 致谢
• 参考文献
• 附录Ⅰ：作者在攻读博士学位期间发表的论文
• 附录Ⅱ：质谱序列分析图谱