番茄灰霉病颉颃细菌的筛选及三株芽孢杆菌诱导番茄对青枯病的抗性研究

论文摘要

番茄灰霉病是由半知菌亚门灰葡萄孢属（Botrytis cinerea Pers.）真菌侵染所引起的,现在已成为番茄栽培中普遍发生的侵染性病害。我们从发生灰霉病的番茄健株和病株的不同生境中（根围、茎围、叶围以及根内、茎内、叶内）分离到的819株细菌中筛选得到116株针对番茄灰霉病菌的颉颃菌。我们测定了116个颉颃菌的产蛋白酶、纤维素酶、几丁质酶活性,以及产嗜铁素、吲哚乙酸情况。通过对116个颉颃菌的16SrDNA限制性酶切图谱（amplified ribosomal DNA restriction analysis,ARDRA）和基因组DNA的BOX-PCR指纹图谱进行分析,我们选择了31株颉颃菌进行了温室防病实验以研究它们是否有生防潜力。结果显示所选菌株的防效在8.06-67.80%。根据第一次温室实验结果我们选择13株防病效果在50%以上的有生防潜力的颉颃菌进一步开展了第2次重复的温室防病及促生实验。结果显示,除了菌株AB16外,其它12个菌株显示了与第1次温室实验相一致的防病效果;并且生防菌处理组病情指数与对照1（只接种病原菌）相比在P＜0.05水平上差异性显著。其中菌株ABc28和ABc22的防效分别达到了66.71%和64.90%。这13个菌株的促生实验也表明,除了菌株ABc1,ABc0,AB16和AB31以外,其它菌株显示了对番茄植株良好的生长促进效应。其中菌株ABc22处理的植株鲜重增加了66.34%。值得注意的是,菌株ABc28,ABc22,ABc11和ABc17这4个菌株的防病效果都在50%以上,而且它们处理过的植株鲜重增加也都在20%以上,显示了良好的商业化前景。菌株鉴定结果表明本研究是第一次用恶臭假单胞菌Pseudomonas putida（AB35）和金黄杆菌Chryseobacterium sp.（ABc1）防治番茄灰霉病,促进番茄生长。本文还研究了3株芽孢杆菌（文山1-18、12LR54和2FG34）对番茄青枯病的防治效果是归因于系统诱导抗病性。当番茄植株用3个菌株分别处理后,青枯病的发生率分别减少了41.3-44.1%、42.3-43.0%和41.8-46.7%,鲜重分别增加19.60%、22.19%和26.85%。离体颉颃实验结果表明,3菌株与病原菌之间均无抑菌圈产生,这表明防治效果的产生不是通过与病原菌的颉颃产生的。细菌定殖实验表明三菌株与病原菌之间在空间上都是隔离的,因此我们推断菌株的防病效果是由于产生诱导抗病性引起的。酶活测定实验进一步表明菌株处理及青枯病原菌HB10接种后,分别能提高PAL、SOD,PPO、PAL和PPO的活性,综合作用的结果是分别提高了相应酶的活性。在次基础上,我们特别分析了菌株文山1-18的防病及促生机理。RT-PCR检测到文山1-18能引起防卫相关基因PR1a（与防卫相关）及生长相关基因Exp2（与促生相关）的大量表达,离体条件下该菌株还能够产生IAA及利用无机磷活性（促进植物生长）。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 文献综述
• 第一章 番茄灰霉病及其生物防治研究进展
• 1.番茄灰霉病害
• 1.1 病原
• 1.2 发病规律
• 1.3 发病症状
• 1.4 危害及防治措施
• 2.微生物防治的研究
• 2.1 利用细菌防治灰霉病的研究
• 2.2 利用真菌防治灰霉病的研究
• 2.3 利用放线菌防治灰霉病的研究
• 2.4 利用内生菌防治灰霉病的研究
• 3.生防机制
• 3.1 颉颃作用
• 3.2 竞争作用
• 3.3 重寄生作用
• 3.4 诱导抗性
• 3.5 抑制果胶酶活性
• 3.6 促生作用
• 4.问题与展望
• 参考文献
• 第二章 番茄青枯病及其生物防治研究进展
• 1.番茄青枯病害
• 1.1 青枯病为害症状
• 1.2 青枯菌菌系的组成
• 1.3 青枯菌的致病机理
• 1.4 病原特征
• 1.5 侵染循环
• 2.生物防治
• 2.1 无致病力青枯菌菌株的利用
• 2.2 有益根际微生物的利用
• 2.3 有益真菌的利用
• 2.4 噬菌体的利用
• 2.5 生物农药的生产利用
• 2.6 抗性植株的构建
• 3.浅析
• 参考文献
• 第二部分 研究内容
• 第一章 番茄生境相关细菌的分离及其对番茄灰霉病的生物防治研究
• 1.材料与方法
• 1.1 分离番茄相关内、外生细菌
• 1.2 病原菌的分离与鉴定
• 1.3 平板对峙法筛选针对灰霉病菌及其它5种病原菌的颉颃菌
• 1.4 颉颃细菌水解酶和次生代谢物活性的测定
• 1.5 颉颃菌16S rDNA限制性酶切图谱（ARDRA）和BOX-PCR指纹图谱分析
• 1.6 颉颃细菌对番茄灰霉病的温室防效试验
• 1.7 颉颃细菌对番茄植株的温室促生实验
• 1.8 菌株鉴定
• 1.9 数据分析
• 2.结果与分析
• 2.1 番茄不同生境细菌种群密度
• 2.2 番茄灰霉病菌的鉴定结果
• 2.3 番茄不同生境颉颃细菌分离结果
• 2.4 离体条件下番茄不同生境颉颃细菌的次生代谢物产生情况
• 2.5 颉颃细菌16S rDNA限制性酶切图谱（ARDRA）和BOX-PCR指纹图谱分析结果
• 2.6 颉颃细菌对番茄灰霉病的温室生防效果
• 2.7 颉颃细菌对番茄植株的温室促生实验
• 2.8 12个具生防潜力菌株的鉴定结果
• 3.讨论
• 参考文献
• 第二章 三株芽孢杆菌诱导番茄对细菌性青枯病的抗性
• 1.材料与方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 细菌菌株
• 1.3 青枯菌对番茄苗的致病性测定
• 1.4 筛选菌株与青枯菌的离体颉颃实验
• 1.5 通过叶部喷雾法进行ISR的生物测定
• 1.6 生防菌株处理对番茄生长的影响
• 1.7 植物组织中细菌的定殖
• 1.8 酶活样品的采集及酶活测定
• 1.9 IAA产生及利用无机磷测定
• 1.10 RT-PCR样品的采集及检测
• 2.结果
• 2.1 致病性测定
• 2.2 三个菌株对番茄青枯病的防治效果
• 2.3 三个菌株对番茄植株的促生长效果
• 2.4 颉颃实验结果
• 2.5 定殖实验结果
• 2.6 酶活测定结果
• 2.7 IAA产生及利用无机磷活性测定结果
• 2.8 RT-PCR结果
• 3.讨论
• 参考文献
• 全文结论
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文