棉铃虫P450基因CYP9A12和CYP9A17的功能表达与拟除虫菊酯代谢

论文摘要

棉铃虫Helicoverpa armigera（Hübner）属于鳞翅目夜蛾科实夜蛾亚科棉铃虫属,是一种世界性的重要经济害虫。棉铃虫对杀虫剂的抗性以及对植物防御物质的适应性是人们长久以来密切关注的重要问题。细胞色素P450是一类庞大的基因家族,它几乎存在于所有的生物体中。棉铃虫体内的细胞色素P450关系到它的生长发育以及对外界环境的适应性,具有重要的生物学意义。属于CYP9和CYP6家族的多个P450基因的过量表达与棉铃虫对外来化合物的解毒代谢有关。本文对棉铃虫细胞色素P450 9家族基因CYP9A12和CYP9A17v2进行了表达及功能方面的研究,同时构建了棉铃虫细胞色素P450 6家族基因CYP687和CYP6AE14酵母表达载体。一、田间棉铃虫P450基因（CYP9A12和CYP9A17v2）mRNA差异表达以EF-1a作为参照基因,采用半定量RT-PCR的方法比较了棉铃虫江浦种群六龄幼虫中肠、脂肪体和雌雄蛹、雌雄成虫中CYP9A12、CYP9A17v2的mRNA表达水平。结果表明:CYP9A12和CYP9A17v2在中肠中的表达量均高于脂肪体中的表达量,CYP9A17v2在棉铃虫中肠和脂肪体中的表达量要高于CYP9A12在相应组织中的表达量。CYP9A12和CYP9A17v2 mRNA在蛹期和成虫期不表达或表达量极低。二、棉铃虫细胞色素P450基因外源表达产物对拟除虫菊酯类药剂的代谢细胞色素P450氧化酶解毒代谢作用增强是棉铃虫对拟除虫菊酯类药剂产生抗性的主要原因,棉铃虫细胞色素P450氧化酶基因CYP9A12,CYP9A17v2的组成型过量表达与拟除虫菊酯抗性相关。以pYES2作为表达载体,在酵母W（R）菌株中表达了棉铃虫细胞色素P450基因CYP9A12和CYP9A17v2,分析了这两个基因的异源表达产物对溴氰菊酯、氟氯氰菊酯、甲氰菊酯和联苯菊酯四种拟除虫菊酯类药剂的离体代谢作用。代谢实验结果表明:含有CYP9A12外源基因的重组酵母细胞裂解液对溴氰菊酯、氟氯氰菊酯和联苯菊酯的代谢率分别为8.58 pmol deltamethrin/min/mg protein,5.85 pmolcyhalothrin/min/mg protein,3.94 pmol bifenthrin/min/mg protein;含有CYP9A17v2外源基因的重组酵母细胞酶液对溴氰菊酯和氟氯氰菊酯的代谢率分别为9.06 pmoldeltamethrin/min/mg protein,5.61 pmol cyhalothrin/min/mg protein;各重组酵母细胞裂解液均检测不到对甲氰菊酯的代谢。三、棉铃虫细胞色素P450（CYP687、CYP6AE14）酵母表达载体的构建根据NCBI上已经登陆的CYP6家族序列设计特异性引物,从室内氰戊菊酯抗性品系YGF中克隆出两个CYP6家族（CYP6B7,CYP6AE14）编码区全长基因。测序结果表明:CYP687和CYP6AE14编码区长分别为1512bp和1578bp,分别编码504和526个氨基酸。与NCBI中已经登陆的CYP687和CYP6AE14基因序列的氨基酸相似性均为99%。选用pYES2作为酵母系统表达载体,将目标基因成功连接到pYES2中,为外源基因在酵母表达系统中顺利表达和进一步的基因功能验证奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.细胞色素P450概况
• 1.1 细胞色素P450的命名
• 1.2 细胞色素P450的结构特征
• 1.3 细胞色素P450蛋白保守和可变区域
• 2.细胞色素P450酶系的循环催化机制
• 2.1 细胞色素P450酶系的循环催化机理
• 2.2 P450酶系催化的反应类型
• 2.3 细胞色素P450活性检测方法
• 3.昆虫细胞色素P450功能的研究
• 3.1 昆虫细胞色素P450对内源性生理物质的代谢
• 3.2 昆虫细胞色素P450对异源物质的代谢
• 3.3 昆虫细胞色素P450结构与功能关系的研究
• 4.细胞色素P450基因在昆虫代谢抗性中的研究
• 4.1 CYP6家族与昆虫抗药性
• 4.2 细胞色素P450介导的昆虫抗药性的分子基础
• 5.昆虫细胞色素P450基因的异源表达系统
• 5.1 大肠杆菌表达系统
• 5.2 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）表达系统
• 5.3 杆状病毒介导的昆虫细胞表达系统
• 5.4 哺乳动物细胞表达系统
• 5.5 转基因昆虫表达体系
• 第二章 田间棉铃虫P450基因（CYP9A12和CYP9A17v2）mRNA差异表达
• 1.材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 主要试剂
• 1.3 总RNA提取及cDNA第一链合成
• 1.3.1 棉铃虫总RNA提取
• 1.3.2 琼脂糖凝胶电泳检测总RNA
• 1.3.3 cDNA第一链合成
• 1.4 半定量PCR
• 1.4.1 半定量PCR引物
• 1.4.2 半定量PCR反应体系
• 2.结果与分析
• 2.1 半定量PCR结果分析
• 3.讨论
• 第三章 棉铃虫P450基因酵母表达产物对拟除虫菊酯的代谢
• 1.材料与方法
• 1.1 化学试剂
• 1.2 棉铃虫CYP9A12和CYP9A17v2的酵母转化
• 1.3 PCR检测外源基因CYP9A12和CYP9A17v2mRNA在酵母诱导培养中的表达
• 1.4 诱导外源基因表达
• 1.5 酵母细胞反应酶液的提取
• 1.6 酵母细胞裂解液对硝基苯甲醚O-脱甲基活性（PNOD）检测
• 1.7 蛋白质浓度测定
• 1.8 酵母表达外源基因产物对拟除虫菊酯类药剂的代谢
• 1.9 气谱分析
• 2.结果
• 2.1 PCR检测外源P450基因在酵母中的表达
• 2.2 重组酵母细胞裂解液PNOD活性检测
• 2.3 酵母表达外源基因产物对拟除虫菊酯类药剂的代谢
• 2.3.1 拟除虫菊酯类药剂标准样品的气谱检测
• 2.3.2 拟除虫菊酯类药剂标准曲线的建立
• 2.3.3 重组酵母细胞裂解液对拟除虫菊酯类药剂的代谢
• 3.讨论
• 第四章 棉铃虫细胞色素P450（CYP687、CYP6AE14）酵母表达载体的构建
• 1.材料与方法
• 1.1 供试昆虫
• 1.2 化学试剂
• 1.3 棉铃虫总RNA提取及cDNA第一链合成
• 1.4 PCR扩增CYP687和CYP6AE14全长基因
• 1.4.1 PCR产物回收与纯化
• 1.4.2 质粒载体的连接反应与转化
• 1.4.3 细菌扩大培养
• 1.4.4 目标片段的检测
• 1.5 双酶切酵母表达质粒pYES2、CYP687和CYP6AE14
• 1.5.1 双酶切反应
• 1.5.2 连接反应
• 1.5.3 转化大肠杆菌,扩大培养
• 1.5.4 质粒提取及双酶切检测
• 1.6 酵母培养
• 1.6.1 酵母菌株
• 1.6.2 酵母培养基
• 1.6.3 转化酵母细胞
• 2.结果与分析
• 2.1 目标片段的获得
• 2.2 棉铃虫CYP687和CYP6AE14基因序列分析
• 2.3 CYP687和CYP6AE14表达载体的构建
• 2.3.1 CYP687、CYP6AE14及pYES2质粒双酶切
• 2.3.2 CYP687、CYP6AE14重组表达载体检测
• 3.讨论
• 全文总结
• 附录:发表的学术论文
• 参考文献
• 致谢