论文摘要
铝（aluminum）是地壳中含量最丰富的元素之一，大量蓄积可产生神经毒性作用。国内外流行病学调查和研究表明，铝易致神经元损伤，引起智力和认知能力下降等学习和记忆方面的缺欠。目前动物实验已证实，铝暴露可致大鼠痴呆，其不仅表现为学习记忆的行为障碍，而且其病理形态学改变也与阿尔茨海默病（AD）相似。海马是学习和记忆的关键脑区，海马长时程增强（long-term potentiation，LTP）是NMDA受体依赖性突触传递效能的持续性增强，是公认的脑学习记忆功能在突触水平的研究模型和细胞基础。因此研究铝暴露对LTP及与其突触机制有关的各项生化指标的影响，有助于从突触和蛋白分子水平阐明铝损害脑学习记忆功能的作用机制。目前虽然铝对LTP损害作用的观察很多，但铝对LTP损害作用的突触机制尚未完全阐明。母体期是子代发育的重要阶段。母体如果在此阶段遭受了铝暴露，是否会影响子代的发育，特别是智力和认知能力的发育，这是一个关系到婴幼儿健康的重要问题，有必要对此进行深入研究。本文拟从母体慢性铝暴露对子代鼠记忆行为和[Ca2+]i、CaMKⅡ的影响角度，对此问题作以初步探讨，为揭示铝暴露损害脑学习记忆功能的神经机制提供资料。材料与方法1、动物分组与染毒断乳健康Wistar大鼠32只（由中国医科大学实验动物中心提供），体重150～200g，♀：♂为3：1。适应饲养环境1wk后，按体重随机分为3组：对照组（control）：饮用蒸馏水；低剂量组（用0.2％-Al表示）和高剂量组（用0.4％-Al表示）分别饮用浓度为0.2g／100ml和0.4g／100ml的AlCl3水溶液。每组♀鼠6-10只，在饲料相同条件下，通过自由饮水对各组动物进行染毒，连续染毒1个月。然后每组分别繁殖子鼠，子代鼠出生后通过母乳行间接铝暴露，直至断乳（生后21天）止。断乳后各组子代鼠均以蒸馏水喂养，自由进食水，至子鼠体重达150～250g。然后按原母鼠染毒的剂量分组，每窝取出1-2只子鼠，组成子代各实验组（实验过程中每14d称重1次）。各组分批交替进行各项测试实验。动物室温度控制在18℃-23℃，相对湿度45％-55％，光照时间12h：12h。2、学习记忆的行为学测定采用跳台法即步下实验（step-down test）检测铝对记忆行为的影响，记录记忆行为中第1次跳下平台的时间（潜伏期）和5min内鼠跳下平台受到电击的次数（错误次数）。3、电生理LTP测定乌拉坦麻醉后，将动物头部固定于脑立体定位仪上，在Schaffer侧枝部位（坐标：前囟后3.3mm；旁开3.8mm；皮层下3.8mm）插入刺激电极。将记录玻璃微电极插入海马CAl区部位（坐标：前囟后3.3mm；旁开1.5mm；电极尖端先抵皮层表面，然后逐步推进）行细胞外记录。找到稳定的群体锋电位（population spike，PS）后，首先记录30min，每分钟给予一次单脉冲刺激所诱发的PS。然后观察给予同样强度及波宽的短串高频条件刺激后，每分钟给予一次单脉冲检验刺激所诱发的PS的幅值变化。4、海马细胞内游离钙的测定心脏采血并取脑，分离出海马组织并去除脑膜血管，制备成单细胞悬液，然后用Fura-2／AM避光孵育负载，调激发波长340nm，发射波长510nm，采用日立F-3000型荧光双波长分光光度计测定。5、海马钙调蛋白依赖性激酶Ⅱ（CaMKⅡ）的表达实验子鼠立即断头取脑分离并取双侧海马组织后按体积比为1：6-1：9放到预冷的裂解缓冲液中。4℃超声粉碎后12000 r·min-1离心1h，取上清分装。按照常规Western blot方法分离蛋白质。将蛋白印迹显影图扫描，再利用ChemiImager 5500 V2103图像分析软件对实验结果（测定目标带灰度值）进行分析。6、海马形态学超微结构观察取子鼠海马用透射电镜观察母体慢性铝暴露情况下子鼠海马的神经元细胞的改变。7、脑组织及血液中铝含量测定准确称取0.1～0.5g的脑组织或准确吸取0.2～0.5ml的全血于石英烧杯中，加5～8ml混酸，同时做空白对照。采用原子吸收石墨炉法测定脑铝和血铝含量。8、统计学处理实验所得数据资料用（?）±s表示，组间资料统计用（SPSS软件）单因素方差分析（ANOVA）检验，记忆保持的潜伏期和5min错误次数不服从正态分布，采用秩和检验。实验结果1、各组间PS幅值变化（即LTP增强率）的比较高频刺激后，两暴露组PS幅值增强率（相对于基线值的百分数）逐渐减小，与对照组相比差异非常显著（P＜0.01），但两铝暴露组之间差异不显著。2、各组子鼠的记忆行为表现随着染毒剂量的加大，大鼠第1次跳下平台的潜伏期（latencies）逐渐缩短，5min内错误次数（error number）有所增加。两铝暴露组大鼠第1次跳下平台的潜伏期与对照组相比差异均非常显著（P＜0.01），且0.2％-Al组和0.4％-Al组之间亦有显著性差异（P＜0.01）；5min内错误次数与对照组相比也均存在显著差异（P＜0.01），且0.2％-Al组和0.4％-Al组之间亦有显著性差异（P＜0.01）。3、子鼠海马神经元的细胞内[Ca2+]i随着铝暴露剂量的增加子鼠海马神经元的细胞内Ca2+浓度([Ca2+]i)逐渐降低。两铝暴露组与对照组相比均降低，0.2％-Al组与对照组的差异无显著意义（P＞0.05），0.4％-Al组与对照组的差异则具有显著意义（P＜0.01），且0.2％-Al组与0.4％-Al组之间的差异也具有显著意义（P＜0.05）。4、子鼠海马CaMKⅡ的表达与对照组相比，两铝暴露组海马CaMKⅡ的表达明显降低具有统计学意义（P＜0.01），并且0.2％-Al组和0.4％-Al组之间亦有显著性差异（P＜0.01）。5、海马形态学超微结构观察与对照组相比，两铝暴露组海马神经元受到损伤，细胞膜溶解，核破损，细胞质溶解，细胞器破坏，线粒体损伤尤重。6、各组子鼠的血铝和脑铝含量随着染毒剂量的增高，全血及脑组织中的铝浓度逐渐增加且明显高于对照组（P＜0.05及P＜0.01），且二者变化趋势一致。讨论母体期（孕期和哺乳期）慢性铝暴露的子代鼠，其血铝和脑铝含量明显增高，LTP的增强率明显下降，记忆行为表现出跳下平台的潜伏期明显缩短，5min内错误次数明显增加，表明母体的铝暴露，可通过胎盘进入子代大鼠体内，造成铝在子代体内蓄积，特别是脑内的蓄积，进而损害了子代鼠的记忆能力。本实验观同时察到，此时子代鼠海马神经元[Ca2+]i和Ca2+／CaMKⅡ的表达也降低，提示子代鼠记忆能力下降的可能原因之一是铝干扰了海马神经元细胞内的Ca2+稳态平衡并进一步抑制了CaMKⅡ的表达。有研究表明，铝可阻断电压依赖性钙通道（VDCCs）；和抑制磷脂酶C（PLC）催化的磷脂酰二磷酸肌醇（PIP2）的水解，造成作为第二信使的三磷酸肌醇（IP3）和二酰甘油（DG）生成减少，进而影响了Ca2+的内流和内质网钙库中Ca2+的释放。铝一方面降低了细胞内Ca2+浓度，另一方面铝与钙竞争，抑制了钙与CaM的结合，并使其构型改变，阻断了Ca2+依赖性CaMKⅡ的作用，干扰了磷酸化过程。同时铝对CaMKⅡ参与LTP诱导与维持过程中所需的NMDA受体和AMPA受体等也有影响，因而进一步抑制了CaMKⅡ的表达。铝能够引起线粒体和DNA的损伤进而导致神经元细胞的损伤和凋亡。综上所述，有理由认为铝影响学习记忆能力的可能原因之一是其可通过多种途径引起细胞内Ca2+浓度降低，并进一步抑制了CaMKⅡ的表达。结论1、母体期慢性铝暴露可使PS幅值增强率减小，提示铝暴露损害了大鼠LTP的诱导与维持；2、母体期慢性铝暴露可使子代大鼠第1次跳下平台的潜伏期缩短，5min内错误次数增加，提示铝暴露损害了大鼠的记忆行为；3、母体期慢性铝暴露可致子代大鼠神经元细胞损伤；4、铝损害LTP和对神经元细胞的损伤的可能机制之一是铝造成了海马中的细胞内Ca2+浓度降低，并进一步抑制了CaMKⅡ的表达。