芽胞杆菌发酵液中抗菌脂肽的定量检测方法及应用

论文摘要

抗菌肽（Antimicrobial Peptides）是生物体内经诱导产生的生物界中广泛存在的一类生物活性小肽,是两性分子,常带正电荷。根据来源不同,可分为动物体来源、植物体来源和微生物来源。抗菌脂肽是芽孢杆菌属产生的微生物来源的抗菌肽,具有抗细菌、真菌、病毒和支原体的功能,在抗菌的同时又不破坏动物体内的正常细胞,对人体安全,在生物医药方面具有重要的应用价值。此外,脂肽作为一种生物表面活性剂在石油工业、食品、化妆品和农业上有着广泛的应用价值。本文着重研究了抗菌脂肽的高效液相色谱定量检测方法,为抗菌脂肽的应用奠定基础。本研究包括以下四方面内容:1.用管碟法建立了青霉素效价的标准曲线Y=0.0057x+2.6048,相关系数达到0.9955。重复3次制作标准曲线,曲线间的相对标准偏差小于4%。以此标准曲线测定得1g抗菌脂肽粗样效价达到0.93×106IU。2.建立了一种以高效液相色谱测定发酵液中表面活性素（surfactin）含量的新方法。采用COSMOSIL 5C18-AR-Ⅱ（4.6×250mm）色谱柱,以乙腈（含0.1%三氟乙酸）和水（含0.1%三氟乙酸）为流动相,流速0.84mL/min梯度洗脱,210nm紫外检测,在20min内检测到surfactin。结果表明,运用本方法在1～100mg/L范围内surfactin浓度与积分面积之间具有良好的相关性（r=0.9998）,精密度为1.5%,检出限为1mg/L,回收率达到96.59%。3.自制了芬荠素（fengycin）相对纯品,并且建立了一种以高效液相色谱测定发酵液中fengycin含量的新方法。采用COSMOSIL 5C18-Ms-Ⅱ（4.6×250mm）色谱柱,以乙腈（含0.1%三氟乙酸）和水（含0.1%三氟乙酸）为流动相,流速0.8mL/min梯度洗脱,230nm紫外检测,在30min内检测到fengycin。结果表明,运用本方法在5～300mg/L范围内fengycin浓度与积分面积之间具良好的相关性（r=0.9921）,精密度为2.74%,检出限2 mg/L。4.对抗菌脂肽的效价及应用作了研究。用双层琼脂法计算得1g抗菌脂肽粗样的效价达到1.1×106IU;以抗菌脂肽粗样配合山梨酸钾和乙二胺四乙酸二钠（EDTA）对常温下酸奶的保鲜作用做了研究,结果表明,25℃条件下,以抗菌脂肽0.5g/kg、山梨酸钾0.2g/kg、EDTA0.13g/kg配比时能显著抑制酸奶中微生物的繁殖,使酸奶在常温下的保质期达到10d以上。

论文目录

• 表格索引
• 图形索引
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 抗菌脂肽研究进展
• 1.1 抗菌脂肽作用机制
• 1.2 抗菌脂肽的产生菌株
• 1.3 抗菌脂肽的结构及特性
• 1.3.1 表面活性素（surfactin）
• 1.3.2 芬荠素（fengycin）
• 1.3.3 制磷脂菌素（plipstatin）
• 1.3.4 伊枯草菌素（iturins）
• 1.4 抗菌脂肽的合成机理及代谢调控
• 2 抗菌脂肽的常用检测方法
• 2.1 薄层色谱法（TLC）
• 2.2 液相色谱
• 2.3 电泳法
• 3 抗菌脂肽的应用及前景
• 3.1 除去受污染土壤中的重金属离子
• 3.2 新药物开发
• 3.3 食品防腐剂
• 3.4 做为饲料添加剂
• 4 本研究的主要内容及意义
• 参考文献
• 第二章 淀粉液化芽胞杆菌发酵液效价测定
• 1 材料与方法
• 1.1 主要试剂与仪器设备
• 1.2 实验菌株
• 1.3 方法
• 1.3.1 样品发酵方法
• 1.3.2 双层琼脂平板的制作
• 1.3.3 制作标准曲线
• 1.3.4 测定样品效价
• 2 结果与讨论
• 2.1 效价标准曲线
• 2.2 发酵液效价测定
• 3 结论
• 参考文献
• 第三章 高效液相色谱法测定芽胞杆菌发酵液中surfactin的含量
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 仪器
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 培养基
• 1.1.4 实验菌株菌种
• 1.2 方法
• 1.2.1 标准溶液的制备
• 1.2.2 发酵方法
• 1.2.3 发酵液中surfactin提取方法的优化
• 1.2.4 色谱条件
• 1.2.5 精密度和回收率测定
• 2 结果与讨论
• 2.1 最佳提取条件的确定
• 2.2 流动相的选择
• 2.3 起始流动相配比的选择
• 2.4 方法的线性范围、检出限和精密度
• 2.5 回收率及重复性实验
• 3 结论
• 参考文献
• 第四章 高效液相色谱法测定芽胞杆菌发酵液中fengycin的含量
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 仪器
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 培养基
• 1.1.4 实验菌株菌种
• 1.2 方法
• 1.2.1 样品发酵方法
• 1.2.2 样品前处理方法
• 1.2.3 Fengycin标准溶液的制备
• 1.2.4 液相色谱条件
• 1.2.5 精确度和回收率测定
• 2 结果与分析
• 2.1 制备fengycin
• 2.1.1 浓缩收集
• 2.1.2 fengycin样品的鉴定
• 2.2 流动相洗脱条件的选择
• 2.3 方法的线性范围、检出限和精密度
• 2.4 发酵液样品稳定性
• 3 结论
• 参考文献
• 第五章 抗菌脂肽对酸奶保质期的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 主要试剂与仪器设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 抗菌脂肽单因素抑菌实验
• 1.2.2 复合防腐剂的抑菌试验
• 1.2.3 细菌总数测定方法
• 2 结果与讨论
• 2.1 抗菌脂肽单因素抑菌实验结果
• 2.2 生物化学复合防腐剂的抑菌效果
• 2.3 验证实验
• 3 结论
• 参考文献
• 全文结论
• 创新点
• 致谢
• 硕士学习期间发表的论文