酸性脲酶的制备、纯化及其性质研究

论文摘要

酸性脲酶因能够耐受酸性环境,并且在大部分的低乙醇度酒精饮料中仍具有很高的活性,因而可以用来去除其所含有的尿素,从而降低酒精饮料中的氨基甲酸乙酯。本论文主要对来源于Enterobacter sp. R-SYB082的酸性脲酶进行了提取、纯化及性质研究。在细胞破碎阶段主要考察了高压匀浆法,结果表明在匀浆压力80MPa、匀浆3次、菌体浓度150g/L的条件下破碎效果最佳,细胞破碎率达到了90%,酶活收率为110%。在粗分离阶段应用聚乙二醇-磷酸氢二钾双水相体系对细胞破碎后的粗酶液进行萃取,结果表明在聚乙二醇分子量为4000,聚乙二醇浓度为15%,磷酸氢二钾浓度为10%,体系pH值6.0,NaCl浓度4%时,酸性脲酶的收率达到了83%,纯化倍数为4.5。粗酶经过Superdex200凝胶过滤层析和MonoQ离子交换层析后,回收率42%,纯化倍数为9.18。SDS-PAGE电泳为单一条带,其N端8个氨基酸残基序列为:Ser-Phe-Lys-Met-Asp-Arg-Lys-Gln。表明该条带为同种蛋白。凝胶过滤法测定全酶分子量为430kDa左右,SDS-PAGE测定分子量为72kDa左右,表明该酶为同源六聚体。酶反应的最适pH值为4.5,最适温度为35℃。酶的pH稳定范围为4.0-6.0,在25-55℃之间酶有较好的热稳定性,相对酶活都在80%以上。当酶液在较高温度（65℃）时,保存3h相对酶活仍在50%左右。在35℃,pH4.5时,该酶表观Km及Vmax分别为19.5μmol/L和109μmol urea/ min﹒mg。Na+、Mn2+对酶有一定的激活作用,Ca2+、Zn2+有一定的抑制作用,酒石酸、琥珀酸对酶有一定的激活作用,草酸、乙酸有一定的抑制作用。在两种不同的黄酒中按照0.05U/mL的酶量进行尿素去除实验,在37℃下,处理四天,尿素去除率分别达到了83%和79%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 立题背景及意义
• 1.1.1 立题背景
• 1.1.2 立题意义
• 1.2 国内外研究概况
• 1.2.1 国外研究概况
• 1.2.2 国内研究概况
• 1.3 本论文研究内容
• 第二章 酸性脲酶的制备
• 2.1 前言
• 2.2 材料
• 2.2.1 菌种
• 2.2.2 试剂
• 2.2.3 仪器
• 2.3 方法
• 2.3.1 溶液的配制
• 2.3.2 菌体制备
• 2.3.3 酶活测定及酶活定义
• 2.3.4 蛋白浓度的测定
• 2.3.5 细胞破碎率D 的测定
• 2.3.6 酶活回收率R 的测定
• 2.3.7 高压匀浆法破碎细胞
• 2.3.8 超声法破碎细胞
• 2.3.9 溶菌酶与超声法结合破碎细胞
• 2.3.10 双水相萃取酸性脲酶
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 匀浆压力对细胞破碎过程的影响
• 2.4.2 匀浆次数对细胞破碎过程的影响
• 2.4.3 菌体浓度对细胞破碎过程的影响
• 2.4.4 不同破碎方法的比较
• 2.4.5 聚乙二醇/磷酸氢二钾体系相图
• 2.4.6 体系总浓度对酸性脲酶分配行为的影响
• 2.4.7 体系pH 值对酸性脲酶分配行为的影响
• 2.4.8 NaCl 浓度对酸性脲酶分配行为的影响
• 2.5 本章小结
• 第三章 酸性脲酶的纯化
• 3.1 前言
• 3.2 材料
• 3.2.1 粗酶冻干粉
• 3.2.2 层析填料
• 3.2.3 仪器
• 3.3 方法
• 3.3.1 酶活测定、酶活定义及蛋白浓度的测定
• 3.3.2 方案一
• 3.3.3 方案二
• 3.3.4 SDS-PAGE 电泳
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 ACA34 凝胶过滤层析
• 3.4.2 DEAE 离子交换层析
• 3.4.3 方案一纯化结果分析
• 3.4.4 Superdex 200 凝胶过滤层析
• 3.4.5 MonoQ 离子交换层析
• 3.4.6 方案二纯化结果分析
• 3.5 本章小结
• 第四章 酸性脲酶的酶学性质
• 4.1 前言
• 4.2 材料
• 4.2.1 酶粉
• 4.2.2 试剂
• 4.2.3 仪器
• 4.3 方法
• 4.3.1 溶液的配制
• 4.3.2 酸性脲酶的PVDF 膜印迹
• 4.3.3 N 端序列的测定
• 4.3.4 全酶分子量的测定
• 4.3.5 最适温度
• 4.3.6 最适pH 值
• 4.3.7 温度稳定性
• 4.3.8 pH 稳定性
• 4.3.9 金属离子及有机酸的影响
• m及最大反应速度V_max 的测定'>4.3.10 米氏常数K_m及最大反应速度V_max的测定
• 4.3.11 黄酒中尿素去除率的测定
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 N 端氨基酸残基序列的测定
• 4.4.2 全酶及亚基分子量的测定
• 4.4.3 最适温度
• 4.4.4 温度稳定性
• 4.4.5 最适pH 值
• 4.4.6 pH 稳定性
• 4.4.7 金属离子及有机酸的影响
• m和最大反应速度V_max 的测定'>4.4.8 米氏常数K_m和最大反应速度V_max的测定
• 4.4.9 黄酒中尿素去除率的测定
• 4.5 本章小结
• 第五章 结论与展望
• 5.1 主要结论
• 5.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位论文期间发表的论文
• 附录：酸性脲酶测序报告单