制备Tet调控BCR-ABL融合基因转基因小鼠的初步研究

论文摘要

慢性髓细胞白血病（Chronic Myeloid Leukaemia,CML）是一种起源于多能造血干细胞异常的骨髓恶性增生性疾病,具有特征性融合基因——BCR-ABL。为进一步阐明CML的发生发展机理,人们一直在尝试制备BCR-ABL融合基因转基因小鼠实验模型。理想的CML实验动物模型应能有效地模拟人类CML疾病的临床表现,为CML的研究提供理想的实验研究平台。但是目前多数BCR-ABL转基因小鼠却表现为急性淋巴细胞白血病,试验结果并不令人满意。本实验室试图利用Tet-On诱导系统定时定量的控制BCR-ABL融合基因,在小鼠出生后诱导P210bcr-abl表达,同时利用bcr启动子特异控制Tet-On系统调控蛋白的表达,使P210bcr-abl在小鼠造血干细胞和髓系血细胞中特异表达。通过受时空控制的P210bcr-abl表达避免P210bcr-abl的胚胎毒性,制备符合人CML慢性期疾病表现的BCR-ABL转基因小鼠模型,用于CML发生、发展、转归和干预的基础和临床研究。在前期研究中,本实验室已经成功克隆了1.1 kb人bcr启动子并证实其在髓系细胞中具有相对组织特异性表达的特性,成功构建了pbcr-Tet-On-tTs和pTRE2-BCR-ABL-Hyg两个重组质粒。在上述工作的基础上,我们首先将pbcr-Tet-On-tTs和pTRE2-BCR-ABL-Hyg两个重组质粒共转染人急性髓细胞白血病细胞株HL-60细胞,采用强力霉素DOX诱导bcr启动子控制的调控蛋白rtTA在髓系血细胞中特异表达,双转染阳性的HL-60细胞中P210bcr-abl的表达与DOX浓度存在量效关系。在细胞水平验证Tet-On调控的、特异性表达BCR-ABL融合基因表达系统的有效性后,我们将bcr-Tet-On-tTS和TRE2-BCR-ABL基因元件通过显微注射的方法分别或共注射到ICR×C57BL/6杂交F1代鼠的雄原核中,试图制备Tet-On系统调控融合基因BCR-ABL表达的转基因小鼠模型。转基因整合的鉴定是进行转基因动物制备的重要环节之一,聚合酶链反应（Polymerase chain reaction, PCR）因其灵敏度高、操作简便等原因而成为转基因动物筛选的主要检测方法之一。为了提高PCR法筛选BCR-ABL融合基因转基因小鼠检测的准确性与可信度,我们从模板质量、引物、Taq酶浓度、Mg2+浓度、退火温度等方面对用于BCR-ABL融合基因转基因小鼠初筛的PCR方法进行优化,努力提高PCR反应的灵敏度与特异性。同时我们通过严格操作规范,协同紫外照射等方法来避免环境污染。在本研究中,我们在116只受体鼠中移植了2550个原核显微注射卵,共出生小鼠212只,显微注射的成功率为60.9%,小鼠出生率为8.3%。其中TRE2-BCR-ABL和bcr-Tet-On-tTS双基因注射移卵1709个,出生小鼠37只,小鼠出生率为2.2%;TRE2-BCR-ABL单基因注射移卵281个,出生小鼠25只,小鼠出生率为8.9%;bcr-Tet-On-tTS单基因注射移卵560个,出生小鼠150只,小鼠出生率为26.8%。我们对出生的转基因小鼠采用优化后的PCR方法进行了初筛,结果筛选到三只BCR-ABL基因阳性鼠,其中一只经Southern blot实验证实,其后代共有21只鼠,均未检测到BCR-ABL基因整合的阳性鼠。目前没有筛选到转pbcr-Tet-On-tTS基因阳性的小鼠。目前,我们正在积极地分析原因,以期能够尽快获得Tet-On系统调控融合基因BCR-ABL表达的转基因小鼠模型。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 研究内容
• 第一部分 Tet 调控的 BCR-ABL 融合基因时空特异表达系统有效性验证
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 第二部分 优化用于 BCR-ABL 融合基因转基因小鼠初筛的 PCR 方法
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 第三部分 Tet 调控的 BCR-ABL 融合基因时空特异表达的转基因小鼠的制备及检测
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 文献综述 转基因动物的制备方法及其鉴定技术
• 致谢