大豆绥农14灌浆期籽粒cDNA文库的构建及表达序列标签（EST）分析

论文摘要

大豆是世界上食用油和高蛋白的主要植物资源,也是豆科植物代表。对其表达序列标签（EST）进行功能基因组的研究,可以增加遗传图谱标记的密度,发掘新的大豆基因,进行SNPs分析论证,利用EST进行大规模基因表达水平分析,从整体水平了解植物组织基因表达情况,进而从分子水平上理解分析生物体的生物活动过程。本研究以我国大面积播种的优良大豆品种绥农14为材料,构建了其正常生长条件下鼓粒时期的籽粒cDNA文库,并进行大规模的序列测定及分析,旨在通过序列分析,发现大豆新的序列,新的全长基因,新型标记,构建基因表达图谱,揭示大豆优良性状特性。获得的研究结果主要如下:1以大豆绥14灌浆期籽粒为材料,利用改良的SMART技术构建cDNA文库共2个。其中R6鼓粒盛期构建的cDNA文库记为Gm-R6,文库原始库容量0.8×106pfu/ml,插入片断平均大小在0.9kb,主要集中在0.5-2kb,重组率接近97%;而在R5鼓粒初期的文库记为Gm-R5,文库原始库容量1.2×106pfu/ml,扩增厚文库库容1.6×109pfu/ml,插入片断在0.5-2kb之间,插入片断平均大小为1.0kb,重组率98%。通过改进SMART技术,搭建了cDNA文库构建技术,为大豆基因组研究提供了帮助。2两个文库共测序2495条序列,对其组装后的1697个Unigene进行BLAST同源分析,与已知功能同源的有1566个,占92.3%,其中分值Score>80占74%。其中参与能量代谢、蛋白合成绩蛋白储藏的基因表达的较丰富,而涉及信号转导途径、胞内运输的表达的基因较少。其中与拟南芥同源的基因最多,其次是苜蓿和水稻及一些豆科类植物,与已知大豆基因比对上的有152个基因,另外推测大豆新基因347个。3通过对Gm-R6文库中蛋白酶抑制剂分析,设计引物利用PCR克隆了4个大豆胰蛋白酶抑制剂,发现其存在新的等位变异位点,并对种子发育时期构建文库进行比较,推测胰蛋白酶抑制剂随着种子的发育变化而高丰度表达,对豆科类植物、花生、水稻等植物做Bowman-Birk Inhibitor聚类分析,结果表明豆科类植物之间的亲缘关系最近。4结合NCBI下载的30个种子、豆荚和子叶cDNA文库及已构建的Gm-R5、Gm-R6、Gm-LN和Gm-LS四个文库,共88,399条序列,通过序列功能分析,表明表达丰度较高的基因有生长调节蛋白,胰蛋白酶抑制因子,叶绿体结合蛋白,脂氧酶,转坐位点,阳离子环氧化剂,原多肽,金属球蛋白,泛素,丁-肌醇-3-磷酸合成酶等。种子发育时期表达的基因不同,在鼓粒初期,涉及能量代谢和蛋白合成的基因最多,种子成熟这个时期蛋白储藏表达的基因最为丰富。5构建的Gm-R5和Gm-R6文库中涉及脂肪合成代谢的基因有65个,涉及蛋白储藏的有19个。Gm-R5文库全长率为45%,Gm-R6文库全长率为38%。通过对cDNA进行密码子分析,发现大豆偏好AAG GAA GAG CAA AAC等密码子。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1 大豆基因组研究
• 2 大豆 EST 研究
• 2.1 cDNA 文库构建
• 2.1.1 大豆 EST 研究进展
• 2.1.2 大豆EST 应用
• 2.2 全长 cDNA 文库的构建方法
• 2.2.1 Oligo-Capping 法
• 2.2.2 CAPture 法
• 2.2.3 SMART 方法
• 2.2.4 CAP-Trapper 法
• 2.2.5 CapSelect 方法
• 2.2.6 CAP-jumping
• 3 EST 研究内容
• 3.1 构建遗传学图谱
• 3.2 用于制备cDNA 微阵列
• 3.3 基因表达分析
• 3.4 分离与鉴定新基因
• 3.5 研究基因表达的动态性
• 3.6 作为外显子标签用于基因组诠释
• 3.7 EST 技术的不足之处
• 4 生物信息学研究
• 4.1 序列比对（Alignment）
• 4.2 结构比对
• 4.3 蛋白质结构预测
• 4.4 非编码区分析和DNA 语言研究
• 4.5 比较基因组学和分子进化
• 5 本研究的目的与意义
• 6 研究总体路线
• 第二章 大豆鼓粒期籽粒 CDNA 文库的构建
• 1 试验材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 正常生长的籽粒
• 1.1.2 试验使用试剂
• 1.1.3 仪器设备
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 籽粒总RNA 提取
• 1.2.2 mRNA 的分离
• 1.2.3 cDNA 的合成
• 1.2.4 双链cDNA 酶切消化和片断化制备
• 1.2.5 载体制备
• 1.2.6 感受态细胞制备和连接方案确定
• 1.2.7 文库质量检测
• 1.2.8 文库中表达序列标签测序
• 2 结果与分析
• 2.1 RNA 质量检测与分析
• 2.2 双链CDNA 的合成
• 2.3 片断化分级分离CDNA
• 2.4 载体制备
• 2.5 文库质量检测
• 第三章 大豆籽粒表达序列标签获得及序列初步分析
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 细菌培养
• 1.2.2 质粒文库的保存
• 1.2.3 质粒抽提（碱裂解法）
• 1.2.4 测序
• 1.3 序列的初步评定
• 1.4 EST 聚类拼接
• 1.4.1 EST 获得和聚类拼接
• 1.5 EST 序列同源性分析
• 1.5.1 BLAST 分析
• 1.5.2 EST 分析
• 1.5.3 对目标基因进行分析及应用，核算分析
• 2 结果与分析
• 2.1 EST 聚类拼接
• 2.1.1 EST 组装参数设置
• 2.1.2 EST 聚类结果
• 2.2 有效 EST 获得
• 2.3 EST 序列同源性分析
• 2.4 同源物种来源比较
• 2.5 基因功能分类
• 2.6 大豆密码子分析
• 3 讨论
• 3.1 EST 的聚类拼接
• 3.1.1 EST 组装参数的设置
• 3.1.2 EST 序列聚类
• 3.1.3 EST 的同源性分析
• 3.2 菌株活力对提取质粒的影响
• 3.3 EST 序列功能注释方法
• 3.4 测序方法的选择
• 第四章 大豆灌浆期籽粒基因表达图谱构建
• 1 材料与方法
• 1.1 用于基因图谱构建的材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 功能基因分类
• 2.2 高丰度表达基因
• 2.3 大豆种子 CDNA 文库比较
• 2.4 全长 CDNA 判定
• 2.5 脂肪代谢相关基因研究
• 2.6 储藏蛋白相关研究
• 第五章 大豆胰蛋白酶抑制剂基因克隆
• 1 材料与方法
• 1.1 CDNA 文库构建及序列组装
• 1.2 胰蛋白酶抑制剂家族序列
• 1.3 分析方法
• 1.4 BBI 家族基因克隆
• 1.4.1 模板 DNA 制备
• 1.4.2 PCR 扩增
• 1.4.3 连接
• 1.4.4 转化并检测
• 2 结果与分析
• 2.1 分子克隆 BBI 三个基因序列
• 2.2 BBI 家族同源序列的比较
• 2.3 聚类分析
• 2.4 大豆籽粒形成时期 CDNA 文库比较
• 3 讨论
• 参考文献
• 附录
• 致谢