复方壳多糖组织工程皮肤基底膜重建的实验研究

论文摘要

皮肤基底膜是位于表皮与真皮之间的一条厚约0.5～1.0μm的重要结构,具有许多重要生物学功能,最明显的功能是紧密连接表皮与真皮,为表皮和真皮提供有力的结合力,避免生理条件下表皮的分离;另一个显著作用是确定表皮细胞的极性,提供表皮移行的屏障。在正常环境中,基底膜可抑制表皮细胞与真皮的直接接触。此外,还具有渗透和屏障等作用,在保持皮肤的完整性中起着不可替代的作用。皮肤基底膜主要由Ⅳ型和Ⅶ型胶原、LN（LN-5、6和10）、巢蛋白和基底膜蛋白多糖等多种成分组成。Ⅳ型胶原和LN是基底膜的两个主要组成成分,Ⅳ型胶原形成一级网络结构,提供显著的机械稳定性,LN结合到Ⅳ型胶原与巢蛋白等相互作用形成二级网络。在超微结构上,基底膜可大致分为三层,即透明板、致密板和纤维网层。透明板是位于致密板和形成高电子密度斑块即半桥粒的基底层细胞之间的区域。锚丝主要由LN-5聚集于透明板形成,与皮肤的半桥粒相对应。致密板主要由Ⅳ型胶原、LN和基底膜蛋白多糖组成的层状结构。纤维网层位于致密板下,含有原纤维,位于表真皮连接的主要由Ⅶ型胶原组成的锚原纤维。表真皮易于分离是目前双层组织工程皮肤的重要缺陷,其根本原因就是因为表真皮间没有构建完整的基底膜。即使形成了基底膜,其结构也不连续,表真皮结合能力不能适应操作需要。表真皮细胞的相互作用可以促进基底膜的成分蛋白如Ⅳ型、Ⅶ型胶原、巢蛋白、LN等大分子的合成,并形成多层次网络结构,共同维持表真皮连接的稳定性。皮肤替代物中致密层形成的形态学顺序如下:（1）沿着基底细胞内侧出现半桥粒结构;（2）局部出现与半桥粒以锚丝相连的致密板;（3）致密层侧向延长。其中,半桥粒结构可能会作为皮肤替代物的核心来促进基底膜的形成,并且半桥粒结构因加入LN-5而获得的增加量可以加速皮肤替代物的基底膜装配。LN-5是一种促进KC粘附非常有效的物质。LN-5定位于跨越透明板的锚丝。在体内,LN-5被证实是在真表皮连接中桥联基底层细胞和致密板的锚丝的的主要组成成分。目前已有学者利用在培养系统中加入外源性LN-5,促进表真皮间基底膜的形成,结果发现,在皮肤替代物中加入外源性LN-5的作用,可以促进致密板的形成,并呈浓度依赖性。本实验利用复方壳多糖组织工程皮肤技术平台,通过调节培养基的钙浓度影响KC与FB的相互作用,促进基底膜的形成;不同时相加入不同浓度的外源性LN,观察基底膜形成情况;首次将力学环境引入组织工程皮肤研究,模拟在体力学环境,对培养的组织工程皮肤进行垂直应力作用,观察种子细胞生物学行为改变后基底膜形成的情况;采用H.E.染色、PAS染色、Ⅳ型胶原、Ⅶ型胶原、CK14、LN等免疫组化染色、电镜等方法,观察基底膜构建情况;在此基础上,采用免疫印迹蛋白表达分析,测定陈旧培养基中游离LN-5的含量情况,探讨LN-5在构建组织工程皮肤基底膜中的作用;建立平板流动腔模型,对重建了基底膜的组织工程皮肤进行流体剪切力的作用,观察组织工程皮肤对剪切应力的耐受情况,初步评价组织工程皮肤的物理性能;将组织工程皮肤移植于动物全层创面,观察移植物覆盖创面情况。本实验获得如下主要研究结果:（1）通过调节培养基钙浓度和加入外源性LN,成功构建结构良好的基底膜,发现高钙环境和在培养7天后加LN更有助于基底膜的形成,加入高浓度的LN形成的基底膜要明显优于低浓度组;（2）首次建立组织工程皮肤的垂直应力作用模型,通过不同的应力作用,发现每天1次,持续15～30min的垂直应力作用,有助于基底膜体外重建;（3）构建了基底膜的组织工程皮肤,其表真皮间Ⅳ型胶原、Ⅶ型胶原及LN的免疫组化反应阳性,表皮下部分CK14染色呈阳性反应;（4）电镜下可见表真皮间有数目不等的半桥粒形成,尤以垂直应力作用后的组织工程皮肤明显;（5）陈旧培养基中游离LN-5的测定,结果提示垂直应力作用可促进KC分泌LN-5,低钙环境有利于KC增殖并合成LN-5,加入外源性LN可有效提高游离LN-5的浓度;（6）构建了基底膜的组织工程皮肤,可以抵抗一定的剪切应力,尤以经过垂直应力作用的组织工程皮肤为佳;（7）组织工程皮肤可有效修复动物全层皮肤缺损创面。本研究通过在培养系统中调节钙浓度,添加外源性LN,成功地构建了基底膜结构,利用H.E.染色、PAS染色、免疫组化、电镜等技术,评价基底膜的组织学结构及重建水平;对LN在组织工程皮肤基底膜重建中的中心作用进行了有益的探索,明确了LN在基底膜分子网络形成中的重要地位;模拟在体毛细血管压力的力学环境,观察了垂直应力作用对基底膜形成的影响,发现给予垂直应力有利于基底膜的重建,并在增加半桥粒的数目上有明显作用;利用平板流动腔模型,对获得的重建了基底膜的组织工程皮肤进行初步的力学评价。本实验结果提示,进行组织工程皮肤器官型培养,培养基钙浓度以1.95mM为宜,LN添加以20μg/ml为宜,且加入的最佳时间是在培养7天后,组织工程皮肤分层分化最好的时间在培养15天左右。本研究首次提出了优化培养条件的方案,证实了LN-5在重建基底膜中的中心作用;首次在组织工程皮肤研究中引入力学因素,证实了力学环境因素对体外构建基底膜的影响,将为皮肤组织工程的研究开辟新的方向,也为进一步理解体外构建基底膜结构的机制奠定了基础。

论文目录

• 英文缩写一览表
• 英文摘要
• 中文摘要
• 论文正文 复方壳多糖组织工程皮肤基底膜重建的实验研究
• 前言
• 第一部分 复方壳多糖组织工程皮肤基底膜重建的优化设计
• 第一节 复方壳多糖组织工程皮肤的制备
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二节 组织工程皮肤培养条件的优化及基底膜重建的组织学特征
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第三节 层粘蛋白-5在组织工程皮肤基底膜重建中的作用研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第四节 基底膜重建的组织工程皮肤家兔移植实验
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 复方壳多糖组织工程皮肤基底膜重建的力学环境影响
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 复方壳多糖组织工程皮肤的力学性能初步评价
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 全文总结
• 不足与展望
• 致谢
• 参考文献
• 文献综述一 表皮基底膜带的超微结构和分子间相互作用
• 参考文献
• 文献综述二 层粘蛋白-5与细胞外间质
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表的文章