论文摘要
脑血管病发病率高,严重危害人类健康。脑中风是最常见的危及生命的神经系统疾病,是当今第三大死亡原因及首位致残原因。但目前对缺血性神经元死亡的机制仍不明确,临床上也缺乏有效的治疗手段。因此,研究神经元的死亡机制,探索新的治疗靶点具有重要的临床意义。迄今为止,关于缺血性神经元损伤的机制有多种学说如:兴奋性毒性,氧化应激、离子失平衡等。钙超载学说一直被认为是缺血性神经元死亡的主要机制,自从发现凋亡过程参与缺血性神经元损伤后,这一传统观点受到了极大的挑战。在交感神经元中,抑制凋亡的Ca2+水平（180-240nM）远低于引起Ca2+超载的毒性水平,谷氨酸毒性作用可引起神经元内Ca2+水平大于5μM。因此,神经元的存活可能依赖于适当的细胞内“钙调定点”。细胞可能有三种不同的Ca2+水平:①低Ca2+水平,神经元凋亡的危险性高;②中等Ca2+水平,神经元易于存活:③具有细胞毒性的高Ca2+水平,易于诱导神经元坏死。脑缺血再灌注后,海马CA1区神经元发生迟发性死亡（Delayed NeuronalDeath,DND）,而CA3区的神经元却几乎不受损害。最近有报道:虽然在缺血期间及缺血后早期,发现CA1锥体神经元钙内流及细胞内钙浓度均增加,然而对单细胞钙染色与形态死亡标记所做的相关分析结果提示,缺血后CA1锥体神经元内钙聚集并不是迟发性神经元死亡的原囚,而是其结果。且另有报道,短暂性全脑缺血后晚期,海马CA1神经元并无Ca2+超载,甚至静息Ca2+水平低于正常。我们实验室最近在短暂性全脑缺血再灌注模型上的研究表明,缺血后24h-48h海马CA1区L-型钙通道介导的电流减少,而CA3区L-型钙通道介导的电流无变化,提示:L-型钙通道功能抑制可能参与了海马CA1区神经元的迟发性死亡。本研究采用改良的Pulsinelli四血管闭塞法建立在体短暂全脑缺血模型和氧葡萄糖剥夺建立离体培养海马神经元缺氧模型,探讨L-型钙通道开通剂BayK8644对缺血性神经元死亡的保护作用以及可能的信号转导机制。实验取180～200g雄性Wistar大鼠,采用改良的Pulsinelli四血管闭塞法建立短暂全脑缺血模型,立体定位,侧脑室埋渗透泵给药法。结果发现:缺血对照组海马CA1区神经元存活数目为35.94±11.8个/mm2,缺血后12h和24h给予0.2mM BayK8644处理组海马CA1区神经元存活数目分别为:145.12±21.0个/mm2和120.94±27.9个/mm2。缺血后12h给予0.1mM BayK8644处理组海马CA1区神经元存活数目为:58.45±25.1个/mm2。与缺血对照组相比,缺血后12h和24h给予0.2mM BayK8644可以显著减少缺血性脑神经元的死亡（P＜0.05）,使CA1区神经元存活数增加3-4倍;而缺血后12h给予0.1mM BayK8644却不能保护缺血性神经元死亡（P=0.986）,说明BayK8644对缺血性神经元的保护作用有浓度依赖性。同时为了证明经BayK8644保护后的神经元是否仍具有功能,我们采用Morris水迷宫行为实验,观察缺血后大鼠空间学习记忆能力的改变,实验在缺血后第9天进行,结果发现,缺血后12h给予0.2mM BayK8644对大鼠的空间学习记忆有改善作用,同时观察到这种改善并不是由于大鼠运动能力改变所引起。上述结果表明BayK8644可以保护在体海马CA1区缺血性神经元的死亡,为进一步观察BayK8644是否以神经元作为靶点来保护缺血性脑损伤,取原代培养海马神经元,培养12天,建立氧葡萄糖剥夺模型,缺氧4h,复氧后继续培养24h。结果显示:缺氧复氧可诱导神经元死亡30%以上,而分别在复氧后1h,3h,6h,12h,给予BayK8644（0.5gM）,可以减少缺氧复氧诱导的神经元死亡50%左右（P＜0.05）。死亡细胞数分别为42±0.8%versus 21±1%,24±2%,22±1%,19±0.7%。同时,为了进一步证明BayK8644是否通过激活L-型钙通道来保护神经元,我们将L-型钙通道的特异性阻断剂nifedipine或nimodipine与BayK8644同时作用于氧葡萄糖剥夺的离体培养海马神经元。与单独给予BayK8644（0.5μM）相比,nifedipine或nimodipine（10μM）可以完全阻断BayK8644的神经保护作用,死亡细胞数分别为15±1%versus 40±%,39±%。大量研究发现MAPK信号通路与细胞生存和凋亡有关,ERK/MAPK级联反应参与了丝裂原和生长因子调控的细胞增殖和分化;一些应激刺激如:紫外线辐射、X射线、热休克、渗透压休克和一些致炎细胞因子如:肿瘤坏死因子,白介素-1,可以使P38和JNK激酶的活性增强。因此,本研究用Western Blot法检测P38、JNK、ERK激酶活性,在培养海马神经元上探讨了BayK8644神经保护作用的信号转导机制。结果发现,复氧后30min,P38和JNK磷酸化水平增高,1h后恢复到正常水平;而ERK激酶的磷酸化水平则在复氧后呈现持续性降低。在复氧12h后给予BayK8644（0.5μM）处理,可以使ERK激酶的磷酸化水平增高。上述结果提示:L-型钙通道开通剂BayK8644可能是通过增强ERK激酶活性来保护神经元的死亡。为证实这一结论,我们在复氧后12h同时给予MEK的特异性阻断剂U0126（10μM）和BayK8644（0.5μM）,观察阻断ERK的上游激酶MEK后对BayK8644保护作用的影响。结果显示:与单独给予BayK8644相比,同时给予U0126可以完全阻断BayK8644的神经保护作用（P=0.000）,死亡细胞数分别为19±0.7%versus 46±2%。综上所述,L-型钙通道开通剂BayK8644可以显著保护缺血性海马CA1区神经元的迟发性死亡,其机制之一可能是激活ERK通路;并且,BayK8644保护下来的神经元仍具有正常的生理功能。