论文摘要
免疫毒素中毒素蛋白部分在体内会产生强烈的非特异毒性,极大地限制了这种靶向制剂的临床应用。为了克服这一问题,本文以毒素蛋白PE38KDEL为模型药物,以聚乳酸/乙醇酸共聚物（PLGA）为载体材料,采用复乳溶剂挥发法制备载PE38KDEL的PLGA纳米粒（PE-NP）;并利用碳化二亚胺法将抗HER2人源化单克隆抗体rhHER2-mAb的靶向功能Fab’片段（anti-HER2 Fab’）连接在纳米粒表面,制备了抗原HER2靶向的载PE38KDEL的PLGA纳米粒（PE-NP-HER）。通过单因素试验和正交设计优化纳米粒制备的处方工艺,确定最优制备条件。并对优选处方纳米粒的粒径、Zeta电位、载药率、包封率、蛋白药物活性、药物体外释放、Fab’连接效率等药剂学体外指标进行了考察与评价。采用激光粒径仪（DLS）和电子透射电镜（TEM）对PE-NP和PE-NP-HER纳米粒表面形态、粒径分布、Zeta电位等性质进行测定:纳米粒呈规则圆形,粒径分布均匀,平均粒径在100～130nm范围。与PE-NP比较,PE-NP-HER的粒径增大（106nm→125nm）及电位改变（-35mV→12mV）可能由Fab’连接于纳米粒表面引起。采用Micro BCA试剂盒法测定PE-NP的载药量、包封率、体外药物释放行为以及PE-NP-HER表面Fab’的连接效率,结果:所制得的优化处方的PE-NP的载药量与包封率分别为7.2±0.3μg/mg和30.1±1.5%（n=9）;PE-NP在前24 h药物突释达28.3%,前96 h药物累计释放达50%;PE-NP-HER表面Fab’连接效率约为19.4μg/mg NP。采用细胞生存率实验（MTT法）评价药物PE38KDEL在纳米粒制备前后的活性损失,结果:纳米粒制备过程中内水相加入稳定剂可以极大地减少PE38KDEL的活性损失。体外实验对PE-NP-HER的靶向功能（即Fab’活性）、体外抗肿瘤效率以及体外抗肿瘤作用机理进行了检测与研究。流式细胞仪（FCM）检测PE-NP-HER的靶向性能（即Fab’活性）;共聚焦显微镜（LSCM）观察PE-NP-HER与靶细胞的作用过程;细胞毒性实验来评价PE-NP-HER对抗原HER2高表达的乳腺癌细胞BT-474的杀伤作用。结果表明,靶向纳米粒表面的Fab’识别并连结于肿瘤细胞,活性良好;LSCM观察:PE-NP-HER可以在Fab’的引导下5分钟内识别并附着于BT-474细胞膜表面,2小时内完成内吞,进入细胞浆;细胞毒性实验中PE-NP-HER对抗原HER2高表达的乳腺癌细胞BT-474具有特异性杀伤作用（细胞生存率为26±3%）。体内试验中,建立了HER2抗原高表达的乳腺癌肿瘤移植小鼠模型,对小鼠尾静脉注射PE-NP-HER和免疫毒素PE-HER（化学连接PE38KDEL与rhHER2-mAb构建而得）以及各种对照治疗因子,评价PE-NP-HER的非特异性毒性和体内抗肿瘤效果。最大耐受剂量实验结果表明:PE-NP-HER显著降低了免疫毒素PE-HER的非特异性毒性（PE-HER组为0.92 mg/kg对应PE-NP-HER组为2.99 mg/kg）;体内肿瘤治疗研究发现:PE-NP-HER（给药剂量0.9mg/kg）抑制肿瘤生长效率明显优于其它治疗因子,小鼠肿瘤体积显著下降（最终肿瘤平均体积为13±6 mm3,n=8,P＜0.01）。结论:这种以anti-HER2 Fab’修饰的肿瘤表面抗原HER2靶向的包裹毒素蛋白PE38KDEL的PLGA纳米粒（PE-NP-HER）,显著地降低了免疫毒素PE-HER的体内非特异性毒性（尤其是肝毒性）;同时,与免疫毒素相比较,PE-NP-HER在体内外抗肿瘤效果显著,对抗原HER2高表达乳癌动物种植模型具有明确疗效,实现了对肿瘤的靶向治疗作用。