农杆菌介导MSI-99基因转化油菜及其植株再生研究

论文摘要

油菜是世界和我国的重要油料作物，而油菜病害是影响油菜的重要限制因素。通过转基因技术将抗性基因转入油菜品种则是解决油菜抗病性的首选战略。MSI-99为一广谱抗菌肽，它已被成功地导入烟草、香蕉和番茄，并表现了很强的抗病能力。将MSI-99基因导入油菜的研究，至今还未见报道。本试验从优化油菜高效再生体系入手，并在此基础上，利用农杆菌介导法将MSI-99基因导入两个油菜双低品种中。 以华双3号和3905两种基因型的子叶柄和下胚轴为受体，通过对8种子叶柄和10种下胚轴再生培养基配方进行比较，筛选出两种基因型材料再生的最佳培养基配方：①适于子叶柄再生的培养基：MS基本培养基+3.0mg／L6-BA+0.2mg／L NAA+3.4mg／L AgNO3（华双3号）；MS基本培养基+5.0mg／L 6-BA+0.2mg／L NAA+3.4mg／L AgNO3（3905）②适于下胚轴再生的培养基配方为：MS基本培养基+4.0mg／L 6-BA+2.0mg／LZT+3.4mg／L AgNO3+500mg／L PVP。 用电转化仪将携有目的基因的双元载体质粒pBIN-MSI99导入农杆菌LBA4404菌株，菌液分别浸染华双3号和3905两个油菜品种的子叶柄和下胚轴外植体，诱导再生后，获得9株kanamycin抗性苗。经PCR检测有7株呈阳性，Southern杂交分析3株有杂交信号，表明外源基因已经整合到再生苗基因组。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 油菜抗病基因工程研究进展
• 1.1.1 油菜抗菌核病基因工程研究
• 1.1.2 油菜抗黑胫病基因工程研究
• 1.1.3 油菜抗病毒病基因工程研究
• 1.2 抗微生物肽Magainin及其衍生物MSI-99
• 1.2.1 Magainins类抗菌肽及其作用机制
• 1.2.2 抗菌肽Magainins与其类似物MSI-99
• 1.3 植物遗传转化方法
• 1.3.1 农杆菌介导法
• 1.3.2 基因枪法
• 1.3.3 农杆菌介导法与基因枪轰击法结合
• 1.3.4 化学药剂诱导转化
• 1.3.5 花粉管通道法
• 1.3.6 脂质体转化法
• 1.3.7 电击法
• 1.3.8 激光微束法
• 1.3.9 显微注射法
• 1.4 研究目的与意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌种与质粒
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 主要生化试剂
• 2.2 试验方法
• 2.2.1质粒pBIN一MSI99的转化、扩增提取与酶切检测.
• 2.2.2 油菜再生体系的筛选
• 2.2.3 Kan（卡那霉素）对芽再生的选择压力的确定
• 2.2.4 Carb（羧苄青霉素）对芽再生的影响
• 2.2.5 农杆菌介导油菜的转化及转化体的筛选
• 2.2.6 转MSI-99基因油菜的分子生物学鉴定
• 第三章 结果与分析
• 3.1 油菜再生体系的筛选
• 3.1.1 种子萌发培养基及无菌苗培养条件
• 3.1.2 不同生长调节剂对子叶柄芽分化的影响
• 3.1.3 不同生长调节剂对下胚轴芽分化的影响
• 3.2 油菜转化体系中抗生素浓度的优化试验
• 3.2.1 子叶柄外植体芽再生过程中Kan浓度确定
• 3.2.2 下胚轴外植体芽再生过程中Kan浓度确定
• 3.2.3 Carb对子叶柄外植体芽再生的影响
• 3.2.4 Carb对下胚轴外植体芽再生的影响
• 3.3 外植体的转化与植株再生
• 3.3.1 细菌转化与质粒检测
• 3.3.2 菌液浓度与浸染时间
• 3.3.3 预培养及共培养条件
• 3.3.4 Kan抗性植株的获得
• 3.4 再生植株MSI-99基因的PCR检测
• 3.5 PCR阳性植株的Southern blot分析
• 3.6 转基因植株的移栽
• 第四章 讨论
• 3对芽分化的影响'>4.1 AgNO₃对芽分化的影响
• 4.2 激素组合对芽再生影响
• 4.3 受体类型对芽再生影响
• 4.3.1 子叶柄外植体
• 4.3.2 下胚轴外植体
• 4.4 外植体生理状态对芽再生的影响
• 4.4.1 苗龄
• 4.4.2 外植体预培养
• 4.5 农杆菌与外植体的共培养
• 4.6 褐化和玻璃苗现象
• 4.7 筛选标记对芽再生的影响
• 4.8 转基因植株与转化率
• 全文结论
• 参考文献
• 附录Ⅰ：培养基基本成分
• 附录Ⅱ：试剂
• 致谢