乐至黑山羊GH、IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ基因的多态性与cDNA克隆及组织表达的研究

论文摘要

加强对山羊多胎性能的遗传机制研究,提高繁殖力,是保护我国优良山羊品种,发展我国山羊生产的重要途径。本研究对高繁乐至黑山羊GH、IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ基因多态性与产羔性能的相关性进行分析,并对乐至黑山羊和藏山羊这3个基因cDNA克隆、序列分析和组织表达研究,以期为揭示乐至黑山羊高繁殖性能的分子机理奠定科学基础。（1）GH、IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ基因多态性与产羔性能的相关性分析:以有前2胎产羔记录的157只乐至黑山羊为研究对象,采用PCR-SSCP技术对GH、IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ基因5’侧翼区和外显子序列进行多态位点的检测,并与乐至黑山羊产羔数进行关联分析。结果显示:GH基因除第一外显子外,其余外显子和5’侧翼区均有单核苷酸突变;IGF-Ⅰ基因只在第2外显子检测到单核苷酸突变,而IGF-Ⅱ基因并未检测到多态位点。统计结果显示GH和IGF-Ⅰ基因的单突变位点对乐至黑山羊产羔率的遗传效应未达到显著水平（P > 0.05）。（2）GH、IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ基因cDNA克隆与序列分析:利用RT-PCR技术克隆得到乐至黑山羊和藏山羊GH、IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ三个基因完整的编码区,CDS编码区长分别654bp、465bp和540bp,编码217、154和179个氨基酸。对其核苷酸序列和氨基酸序列进行比对的结果显示:乐至黑山羊和藏山羊GH基因上存在1处核苷酸差异,并且导致了氨基酸发生变化;IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ基因皆存在2处核苷酸差异,但是没有导致氨基酸的变化。（3）GH、IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ基因的mRNA组织表达研究:以GAPDH为内参基因,采用Real-time PCR技术对发情第1天的乐至黑山羊（n=6）与藏山羊（n=6）垂体、子宫和卵巢上的GH、IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ的mRNA表达量进行测定。结果显示,这3个基因不同组织mRNA表达量的两个山羊品种存在一定差异。本研究首次对乐至黑山羊GH、IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ基因多态性、cDNA克隆和组织表达进行了研究,为揭示山羊高繁殖性能的分子机理奠定了科学基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一章 GH-IGFs 轴基因和研究方法
• 1 生长激素研究进展
• 1.1 生长激素（GH）的结构和功能
• 1.2 生长激素信号传导途径
• 1.3 生长激素的应用
• 2 胰岛素样生长因子（IGFs）研究进展
• 2.1 生长因子
• 2.2 胰岛素样生长因子（IGF）概述
• 2.3 胰岛素样生长因子系统（IGFs）
• 2.4 胰岛素样生长因子（IGFs）研究进展
• 2.4.1 IGF-Ⅰ 研究进展
• 2.4.1.1 IGF-Ⅰ 结构
• 2.4.1.2 IGF-Ⅰ 生物学功能及与动物性状的相关性研究
• 2.4.2 IGF-Ⅱ 研究进展
• 2.4.2.1 IGF-Ⅱ 结构
• 2.4.2.2 IGF-Ⅱ 生物学功能
• 2.4.2.3 IGF-Ⅱ 与基因印记
• 3 DNA 分子标记
• 3.1 DNA 分子标记技术概述
• 3.2 DNA 分子标记的分类
• 3.3 PCR-SSCP 技术
• 3.3.1 PCR-SSCP 技术的原理
• 3.3.3 PCR-SSCP 的应用
• 3.3.3.1 PCR-SSCP 在微生物研究中的应用
• 3.3.3.2 PCR-SSCP 在植物研究中的应用
• 3.3.3.3 PCR-SSCP 在动物育种中的应用
• 4 荧光定量PCR 技术
• 4.1 荧光定量PCR 技术（Real-time fluorescent quantitative PCR，qPCR）
• 4.2 荧光定量PCR 技术的类型及特点
• 4.2.1 DNA 结合染料（SYBR Green I）
• 4.2.2 TaqMan 探针
• 4.2.3 分子信标
• 第二章 乐至黑山羊GH、IGF-Ⅰ 和IGF-Ⅱ 基因多态性与产羔数的相关性研究
• 1 材料
• 1.1 动物样品
• 1.2 主要试剂和仪器
• 1.2.1 主要试剂
• 1.2.2 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 DNA 提取
• 2.2 DNA 浓度和纯度的检测
• 2.3 PCR 引物设计
• 2.3.1 GH 基因 PCR-SSCP 引物设计
• 2.3.2 IGF-Ⅰ 基因PCR-SSCP 引物设计
• 2.3.3 IGF-Ⅱ 基因PCR-SSCP 引物设计
• 2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SSCP）
• 2.5 PCR 产物的纯化
• 2.6 TA 克隆
• 2.7 数据统计
• 2.7.1 基因型频率和基因频率
• 2.7.2 杂合度He 和多态信息含量（PIC）
• 3 结果与分析
• 3.1 基因组DNA 提取效果
• 3.2 目的片段扩增效果
• 3.3 SSCP 检测结果
• 3.3.1 GH 基因SSCP 检测结果
• 3.3.2 IGF-Ⅰ 基因SSCP 检测结果
• 3.3.3 IGF-Ⅱ 基因SSCP 检测结果
• 3.4 序列分析
• 3.4.1 GH 基因多态序列分析
• 3.4.1.1 GH 5’侧翼区多态序列分析
• 3.4.1.2 GH exon2 多态序列分析
• 3.4.1.3 GH exon3 多态序列分析
• 3.4.1.4 GH exon4 多态序列分析
• 3.4.1.5 GH exon5 多态序列分析
• 3.4.2 IGF-Ⅰ 基因第2 外显子多态序列分析
• 3.5 GH 基因的遗传多态性
• 3.6 IGF-Ⅰ 基因ex0112 的遗传多态性
• 3.7 GH 基因单突变位点对乐至黑山羊产羔性状的遗传效应
• 3.8 IGF-Ⅰ 基因单突变位点对乐至黑山羊产羔性状的遗传效应
• 4 讨论
• 4.1 GH 基因多态性及遗传效应
• 4.2 IGFs 的多态性及遗传效应
• 5. 小结
• 第三章 乐至黑山羊与藏山羊GH、IGF-Ⅰ 和IGF-Ⅱ 基因的克隆及组织表达研究
• 1 材料
• 1.1 动物组织的采集
• 1.2 主要试剂和仪器
• 1.2.1 主要试剂
• 1.2.2 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 总RNA 的提取
• 2.2 总RNA 完整性和纯度检测
• 2.3 cDNA 的合成
• 2.4 引物设计
• 2.5 目的片段的PCR 扩增及检测
• 2.6 TA 克隆
• 2.7 荧光定量引物设计
• 2.8 实时荧光定量PCR
• 2.9 统计分析
• 3 结果
• 3.1 RNA 提取质量
• 3.2 目的片段扩增效果
• 3.3 GH 基因序列分析
• 3.3.1 乐至黑山羊和藏山羊GH 基因的序列差异性比较
• 3.3.2 GH 基因CDS 编码区的一致性比较
• 3.3.3 GH 基因氨基酸同源性比较
• 3.4 IGF-Ⅰ 基因序列分析
• 3.4.1 乐至黑山羊和藏山羊IGF-Ⅰ 基因的序列差异性比较
• 3.4.2 IGF-Ⅰ 基因CDS 编码区的一致性比较
• 3.4.3 IGF-Ⅰ 基因氨基酸同源性比较
• 3.5 IGF-Ⅱ 基因序列分析
• 3.5.1 乐至黑山羊和藏山羊IGF-Ⅱ 基因的序列差异性比较
• 3.5.2 IGF-Ⅱ 基因CDS 编码区的一致性比较
• 3.5.3 IGF-Ⅱ 基因氨基酸同源性比较
• 3.6 荧光定量引物的扩增效果
• 3.7 目的基因与看家基因的熔点曲线
• 3.8 目的基因与看家基因的标准曲线
• 3.9 荧光定量结果分析
• 4. 讨论
• 4.1 克隆cDNA 序列分析
• 4.2 基因组织表达量分析
• 5. 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录：研究生阶段发表的论文
• 致谢