论文题目: 巨噬细胞金属弹力酶基因转染CT-26细胞对小鼠原位结肠癌生长及微血管生成的影响
论文类型: 博士论文
论文专业: 老年医学
作者: 石海
导师: 许建明
关键词: 巨噬细胞金属弹力酶,基因克隆,结肠肿瘤,血管内皮生长因子,动物模型
文献来源: 安徽医科大学
发表年度: 2005
论文摘要: 目的 巨噬细胞金属弹力酶(mouse macrophage metalloelastase,MME)是基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)家族成员之一,也称MMP-12。与其它MMP成员不同,MME可以分解纤溶酶原,产生具有抑制血管内皮细胞增殖作用的血管抑素(angiostatin),进而抑制体内肿瘤细胞的生长,在抗肿瘤血管生成中具有重要作用。本研究主要探讨小鼠巨噬细胞金属弹力酶对小鼠原位结肠癌生长、微血管生成及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达的影响。 方法 PCR扩增编码MME基因结构域Ⅰ和Ⅱ的cDNA片段,克隆入pGEM-T载体中,限制性内切酶、DNA序列分析鉴定目的基因后,定向亚克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)中,并进行双酶切及PCR鉴定。再将构建的真核细胞表达载体pcDNA3.1-MME稳定转染小鼠CT-26结肠癌细胞。采用RT-PCR、免疫细胞化学和Western blot方法,鉴定MME mRNA和重组蛋白在CT-26细胞中的表达。采用体外分解Ⅰ型胶原蛋白和明胶酶谱方法,鉴定MME重组蛋白的酶活性。建立MME转染组及对照组小鼠原位结肠癌种植模型,观察MME对原发性结肠癌生长的影响,采用免疫组织化学、原位杂交及Western blot方法检测肿瘤组织中微血管密度(microvessel density,MVD)和VEGF的表达。 结果 以重组质粒pUC9-MME cDNA为模板进行PCR扩增,PCR产物经纯化后,在1%琼脂糖凝胶电泳中可见一条清晰的条带,位于750bp和1000bp之间,与预期的840bp目的基因片段长度相符。pGEM-T-MME用BamHI和XbaI双酶切,产生2个大小分别为3.0kb和832bp左右的条带,与预期结果基本一致。pGEM-T-MME核苷酸序列正向测序和反向测序结果表明,与小鼠MME cDNA序列的碱基符合率为99.63%。pcDNA3.1(+)-MME重组质粒用BamHI和XbaI双酶切,可见2条分别
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巨噬细胞金属弹力酶基因转染CT-26细胞对小鼠原位结肠癌生长及微血管生成的影响
1.前言
2.材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 实验试剂
2.1.2 实验动物
2.1.3 质粒、菌株及细胞株
2.1.4 部分试剂的配制
2.1.5 实验仪器
2.2 实验方法
2.2.1 小鼠MME基因克隆
2.2.1.1 PCR扩增MME cDNA片段
2.2.1.2 PCR产物的纯化
2.2.1.3 纯化后的PCR产物克隆入pGEM-T载体
2.2.1.4 感受态XL_1-blue菌的制备
2.2.1.5 连接产物转化XL_1-blue感受态菌株
2.2.1.6 阳性克隆(pGEM-T-MME/XL_1-blue)的鉴定和重组质粒提取
2.2.1.7 重组质粒pGEM-T-MME的鉴定
2.2.2 构建MME基因真核表达载体
2.2.2.1 目的片段和表达载体质粒的双酶切反应
2.2.2.2 目的片段和表达载体的回收、纯化
2.2.2.3 目的片段与表达载体的连接
2.2.2.4 感受态DH5α菌的制备
2.2.2.5 连接产物转化DH5α感受态菌株
2.2.2.6 阳性克隆(pcDNA3.1-MME/DH5α)的鉴定和重组质粒提取
2.2.2.7 重组质粒pcDNA3.1-MME的鉴定
2.2.3 小鼠CT-26结肠癌细胞的培养
2.2.4 MME真核表达载体稳定转染CT-26结肠癌细胞
2.2.4.1 确定G418筛选浓度
2.2.4.2 磷酸钙共沉淀法转染CT-26细胞
2.2.5 目的基因在稳定转染CT-26细胞中表达的鉴定
2.2.5.1 RT-PCR
2.2.5.2 免疫细胞化学染色(S-P)法
2.2.5.3 western blot分析
2.2.6 重组MME蛋白的酶活性鉴定
2.2.6.1 体外分解Ⅰ型胶原蛋白试验
2.2.6.2 明胶酶谱分析(Gelatin zymography)
2.2.7 BALB／C小鼠结肠癌原位种植模型的建立
2.2.8 原位杂交(ISH)
2.2.8.1 MME原位杂交
2.2.8.2 VEGF原位杂交
2.2.9 免疫组织化学(IHC)染色
2.2.10 CT-26细胞培养上清和原位结肠癌组织中VEGF表达的Western blot分析
2.2.11 统计分析
3.结果
3.1 小鼠MME基因克隆
3.1.1 PCR产物电泳分析
3.1.2 重组质粒PGEM-T-MME的鉴定
3.1.2.1 双酶切鉴定
3.1.2.2 MME核苷酸序列测定
3.2 pcDNA3.1(+)-MME真核表达载体的鉴定
3.3 稳定转染CT-26小鼠结肠癌细胞株的筛选
3.4 目的基因在稳定转染细胞株中表达的鉴定
3.4.1 RT-PCR检测MME mRNA表达
3.4.2 免疫细胞化学染色检测细胞内MME蛋白表达
3.4.3 Western blot检测MME蛋白的表达
3.5 重组MME蛋白的酶活性鉴定
3.5.1 体外分解Ⅰ型胶原蛋白试验
3.5.2 明胶酶谱分析
3.6 小鼠原位结肠癌模型研究
3.6.1 MME对荷瘤小鼠生存时间的影响
3.6.2 MME对小鼠原位结肠癌生长和转移的影响
3.7 MME对小鼠原位结肠癌组织中MVD的影响
3.8 ISH检测原位结肠癌组织中MME mRNA的表达
3.9 ISH检测原位结肠癌组织中VEGF mRNA的表达
3.10 IHC检测原位结肠癌组织中MME蛋白表达
3.11 IHC检测原位结肠癌组织中VEGF蛋白表达
3.12 Western blot检测CT-26细胞培养上清和原位结肠癌组织中VEGF的表达
4.讨论
4.1 MME基因真核表达载体的构建和鉴定
4.2 重组质粒pcDNA3.1-MME在CT-26细胞中的表达
4.3 动物模型研究
5.结论
6.目前存在的问题及下一步计划
参考文献
附录
致谢
综述
参考文献
发布时间: 2005-09-07
参考文献
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