生长激素释放激素—白蛋白融合蛋白的克隆表达和活性鉴定

论文题目: 生长激素释放激素—白蛋白融合蛋白的克隆表达和活性鉴定

论文类型: 硕士论文

论文专业: 微生物与生化药学

作者: 王楠

导师: 刘党生,刘志敏

关键词: 生长激素释放激素,白蛋白,毕赤酵母,表达,生物学活性

文献来源: 沈阳药科大学

发表年度: 2005

论文摘要: 人生长激素(human growth hormone，hGH)具有促进机体生长以及对抗胰岛素和促进合成代谢的作用。生长激素释放激素(growth hormone releasing hormone，GHRH)是一种下丘脑分泌的肽类激素，具有诱导hGH释放的作用。 GHRH应用于临床的最大缺陷在于它在体内的半衰期很短(10-20分钟)。该肽对酶降解十分敏感，特别是对二肽酶Ⅳ(DPPⅣ)最为敏感，二肽酶Ⅳ(DPPⅣ)介导的这种蛋白水解作用是GHRH在体内降解、失活的主要途径。GHRH很短的体内半衰期决定了只有频繁的给药才能取得令人满意的疗效，在临床治疗中采用每天至少注射一次的用药方式，但如此频繁的用药方式给病人带来了很多不便。 人血清白蛋白融合技术(HSA fusion technology)是构建长效蛋白药物的一个通用技术，近年来在长效干扰素(IFN)、粒细胞生长因子(G-CSF)、生长激素(GH)及白介素-2(IL-2)等药物的研制上取得了广泛的应用。为了延长半衰期，本研究构建了HSA和GHRH的融合蛋白，并对其体内疗效进行研究，为开发长效GHRH奠定基础。 本实根据GeneBank上的GHRH的氨基酸序列并以毕赤酵母偏爱密码子替换，通过化学合成和重叠PCR法将生长激素释放激素(GHRH)的N末端和白蛋白(HSA)的C末端通过一个十一肽的接头连接，获得了GHRH和HSA融合的全长基因序列。构建了pPIC9-HSA-GHRH表达载体，电击转化到毕赤酵母中，通过表型筛选和诱导表达得到蛋白表达工程菌，并对表达产物进行了分离纯化和生物学活性分析。动物实验结果表明该融合蛋白在体内具有较好的促增长活性。

论文目录:

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英文摘要

第一章 前言

1.1 人生长激素概况

1.1.1 人生长激素的生物化学

1.1.2 人生长激素的生理作用

1.1.3 生长素分泌的调节机制

1.1.4 生长激素在临床上的应用

1.2 生长激素释放激素概况

1.2.1 生长激素释放激素的研究历史

1.2.2 GHRH的一级结构与活性的关系

1.2.3 GHRH的生理作用

1.2.4 GHRH的作用机理

1.3 人血清白蛋白概况

1.3.1 人血清白蛋白的结构组成

1.3.2 人血清白蛋白的生物功能

1.4 巴斯德毕赤酵母概况

第二章 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 菌株

2.1.2 质粒

2.1.3 白蛋白基因片段

2.1.4 蛋白标准品

2.1.5 限制性内切酶及工具酶

2.1.6 试剂盒

2.1.7 核酸及蛋白分子量标准

2.1.8 引物序列

2.1.9 主要仪器和层析柱

2.1.10 主要试剂

2.1.11 主要培养基

2.1.12 主要溶液

2.2 方法

2.2.1 GHRH基因的获得

2.2.2 HSA-GHRH基因的获得

2.2.3 重组质粒pPIC9-HSA-GHRH的构建

2.2.4 重组质粒pPIC9-HSA-GHRH的转化

2.2.5 重组质粒pPIC9-HSA-GHRH转化子的筛选

2.2.6 巴斯德毕赤酵母菌的电转化

2.2.7 巴斯德毕赤酵母转化子的筛选

2.2.8 巴斯德毕赤酵母转化子在摇瓶里的诱导表达

2.2.9 外标法测定HSA-GHRH在培养上清的表达水平

2.2.10 HSA-GHRH的纯化

2.2.11 HSA-GHRH的纯度分析

2.2.12 重组蛋白理化性质的鉴定

2.2.13 HSA-GHRH的活性测定

第三章 结果

3.1 GHRH基因的获得

3.2 HSA-GHRH基因的获得

3.3 重组质粒pPIC9-HSA-GHRH的构建

3.4 表达载体pPIC9-HSA-GHRH的鉴定

3.5 巴斯德毕赤酵母的转化及转化子的筛选

3.5.1 pPIC9-HSA-GHRH/GS115工程菌株表达克隆的筛选

3.6 用蛋白外标法确定培养上清中HSA-GHRH的表达水平

3.7 表达载体pPIC9-HSA-GHRH/GS115工程菌株的摇瓶培养

3.8 重组蛋白的分离纯化

3.9 重组蛋白理化性质的鉴定

3.9.1 重组蛋白N端氨基酸序列的测定

3.10 重组蛋白生物活性测定

3.10.1 体内活性的测定

3.10.2 长效性的初步测定

第四章 讨论

4.1 几种延长蛋白药物半衰期方法的比较

4.1.1 聚乙二醇修饰的优势

4.1.2 聚乙二醇修饰的局限性

4.1.3 白蛋白融合蛋白的优势

4.2 目的基因的拼接

4.3 巴斯德毕赤酵母菌的转化方法

第五章 结论

第六章 参考文献

致谢

发布时间: 2006-11-27

参考文献

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