脂肪型和瘦肉型猪肌肉生长和脂肪沉积相关基因的差异表达分析和分子网络构建

论文摘要

骨骼肌细胞和脂肪细胞在生长发育过程中受到的微效多基因间的互作调控机制是决定猪胴体和肉质等相关数量性状的分子基础。本研究利用包含140个与猪肌肉生长和脂肪沉积密切相关基因的Oligo功能分类基因芯片,检测了脂肪型的太湖猪和瘦肉型的长白猪在出生后不同生长发育阶段,背最长肌（初生,1,2,3,4和5月龄）和背部皮下脂肪（1,2,3,4和5月龄）中相关基因表达谱的变化。①方差分析（ANOVA）和基因分组检验（GCT）结果显示:背最长肌表达谱中,长白猪分别有18和22个基因,太湖猪分别有3和7个基因在月龄间的表达差异达极显著(PANOVA＜0.01)和显著水平(PANOVA＜0.05),且长白猪中包含10个基因的“参与脂肪酸生物合成的酶”基因分组具有极显著意义(PErmineJ＜0.01)。皮下脂肪表达谱中,长白猪有25个基因在月龄间的表达差异达显著水平(PANOVA＜0.05),且包含23个基因的“参与脂肪或类固醇代谢的酶和调节蛋白”基因分组在品种间具有极显著意义(PErmineJ＜0.01)。提示两猪种骨骼肌生长速度和脂肪沉积能力表型的巨大差异可能与这些基因的差异表达规律相关。②短时间序列表达聚类（STEM）结果显示:背最长肌表达谱中,先降后升、逐渐上升和逐渐下降、逐渐上升分别是长白猪和太湖猪在初生至5月龄间最具代表性的基因表达模式(PSTEM＜0.01),其中正调控肌纤维生长和脂肪酸合成的基因主要表现为逐渐上调,而抑制细胞增殖和正调控脂肪酸β氧化的基因则主要表现为逐渐下降。皮下脂肪表达谱中,长白猪和太湖猪各有两个表达模式分别具有极显著(PSTEM＜0.01)和显著性意义(PSTEM＜0.05),但太湖猪基因表达谱比较分散,占主导优势的表达模式没有长白猪明显,提示太湖猪脂肪细胞内参与相关代谢活动的基因间的调控关系较长白猪复杂。③主成分分析（PCA）结果显示:长白猪和太湖猪的背最长肌表达谱中分别有7和6个基因,皮下脂肪表达谱中分别有16和13个基因的时序表达模式明显偏离其他基因,提示可能受到了特殊的调控。④ANOVA和二维层级聚类的PCA映射结果显示:长白猪分别有42和27个基因,太湖猪分别有51和20个基因在背最长肌和皮下脂肪间的表达差异达极显著(PANOVA＜0.01)和显著水平(PANOVA＜0.05)。53个与脂肪沉积相关基因在两组织内的时序表达模式大致可分为3类,可按照不同标准筛选存在组织特异性表达模式的基因,为探讨IMF和皮下脂肪沉积的分子机制积累了基础资料。⑤基于动态贝叶斯模型（DBN）构建的基因调控网络（GRNs）从一定程度上揭示了两品种在肌肉生长和脂肪沉积等生理生化代谢活动方面的明显差异。网络中基因的调控地位与已知功能信息大致相符,具有一定的准确性和可信度,可从中挖掘相关性状潜在的关键特征基因。⑥Pathway映射结果显示:两个代表脂肪沉积动态平衡的通路——脂肪酸代谢和脂肪酸生物合成,两个代表脂肪沉积调控的通路——PPAR信号转导和脂肪细胞因子信号转导,所涉及的生物学功能在两猪种间和生长发育过程中可能发生了变化。从一定程度上揭示了不同生产类型的两猪种在脂肪沉积性状上巨大表型差异的分子基础。⑦通过基于表达模式识别（STEM）结果的文献网络子网挖掘,在等级分值较高的子网中寻找到了大量已有相关研究支撑、对宏观表型具有重要影响和研究价值的种子基因,建议可作为影响猪肌肉和脂肪性状的关键特征基因进行深入研究。⑧利用物种人的同源基因预测了本研究背最长肌表达谱中差异表达基因间的转录调控网络（TRNs）,发现26个表达差异达显著水平的基因(PAVOVA＜0.05和0.01)受到E2F转录因子（E2F1～8）、上游结合蛋白1（LBP-1/UBP1）、激活增强子结合蛋白2γ（AP2-gamma）和PHD锌指转录因子蛋白（BPTF）等27个转录因子（TFs）具有显著性意义的调控(PTF＜0.05)。提示这些TFs通过调节靶基因的表达,可能对猪肌肉和脂肪性状的最终表型产生重要影响。⑨对片内和片间重复性的评价结果显示:4个片内重复的平均变异系数（?）和3个重复检测芯片间的平均相关系数（?）在皮下脂肪和背最长肌中分别平均为5.95%±3.15%、5.19%±2.87%和0.894±0.038、0.917±0.041,均高于（?）＜15%和r＞0.700的成功实验标准。对两组织内各5个差异表达基因的QRT-PCR验证显示:两种实验方法检测结果均为正相关,相关系数（r）在皮下脂肪和背最长肌表达谱中分别平均为0.874±0.071和0.876±0.095。表明本研究结果准确可靠,检测数据能够真实反映基因的表达变化规律。本研究筛选出了对于猪胴体和肉质性状可能具有重要影响和较大研究价值的基因,初步揭示了生长发育过程中骨骼肌和脂肪细胞基因表达调控的局部分子互作机制,以及造成猪肌肉和脂肪宏观性状表型差异的分子网络基础。

论文目录

• 高频词对照表
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 引言
• 1 选题背景及意义
• 1.1 分子数量遗传学研究猪肌肉和脂肪性状相关基因的不足之处
• 1.2 猪肉宏观性状的系统解析——基因表达谱研究
• 1.3 猪肉基因表达谱研究中的不足
• 2 主要研究内容
• 参考文献
• 第二章 文献综述:猪肉基因（组）研究进展——关注肌肉和脂肪性状的共改良
• 1 猪肉宏观性状的分子基础
• 1.1 骨骼肌发生和脂肪细胞分化增殖
• 1.2 猪出生后骨骼肌的生长发育——肌纤维肥大
• 1.3 猪出生后的体脂沉积——脂肪细胞的分化增殖和肥大
• 1.4 骨骼肌和脂肪的新认识——重要的内分泌器官
• 1.5 骨骼肌与脂肪间的"对话"
• 2 猪肌肉生长和脂肪沉积的相关基因
• 2.1 进行中的猪基因组测序计划
• 2.2 猪肌肉和脂肪性状的QTL和候选基因
• 3 利用基因芯片技术研究猪肉表达谱
• 4 功能分类芯片策略
• 参考文献
• 第三章 长白猪和太湖猪肌肉和脂肪性状的发育性变化研究
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 试验群体
• 2.2 试验日粮
• 2.3 样本采集和性状测定
• 3 数据分析
• 4 结果与分析
• 4.1 石蜡切片（H&E染色）
• 4.2 品种和时间对肌肉和脂肪性状的影响
• 4.3 品种内月龄间、相同月龄品种间肌肉和脂肪性状的比较
• 5 讨论
• 5.1 两猪种生长性能的差异
• 5.2 两猪种脂肪沉积的差异及可能原因
• 参考文献
• 第四章 利用功能分类芯片研究猪肌肉生长和脂肪沉积相关基因的发育表达谱
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 功能分类芯片（Pathway-focused microarray）的设计和制备
• 2.2 杂交方案的设计
• 2.3 RNA的间接荧光标记和芯片的杂交洗涤
• 2.4 芯片扫描及图像处理
• 2.5 数据预处理及标准化
• 3 结果与分析
• 3.1 Total RNA的琼脂糖凝胶电泳
• 3.2 RNA Pool的毛细管电泳
• 3.3 芯片扫描结果
• 3.4 片内标准化结果
• 3.5 提交到NCBI-GEO数据库
• 4 讨论
• 4.1 试验设计
• 4.2 低密度芯片的片内标准化策略
• 4.3 是否需要片间标准化
• 4.4 重复数合并
• 4.5 缺失值估计
• 参考文献
• 第五章 普通数据分析——差异表达分析、基因分组检验、表达模式识别和数据降维
• 1 前言
• 2 分析策略及方法
• 2.1 差异表达分析——ANOVA方法
• 2.2 基因分组检验（GCT）——基因分组重采样（GSR）算法
• 2.3 表达模式识别——时间序列的STEM聚类和非时间序列的二维层级聚类
• 2.4 数据降维——主成分分析（PCA）
• 3 结果与分析
• 3.1 背最长肌表达谱
• 3.2 皮下脂肪表达谱
• 3.3 背最长肌和皮下脂肪表达谱的比较
• 4 讨论
• 4.1 统计结果和分析策略的几点说明
• 4.2 背最长肌表达谱
• 4.3 皮下脂肪表达谱
• 4.4 背最长肌和皮下脂肪表达谱的比较
• 参考文献
• 第六章 高级数据挖掘——分子网络建立
• 1 前言
• 2 分析策略及方法
• 2.1 反向工程学算法——基于DBN模型推导GRNs
• 2.2 生物学通路中的基因分析——Pathway映射（mapping）
• 2.3 文献信息挖掘——基于NLP技术的网络分析
• 2.4 转录因子结合位点（TFBS）鉴定——同源预测TRNs
• 3 结果与分析
• 3.1 基因调控网络（GRNs）
• 3.2 Pathway映射
• 3.3 文献网络
• 3.4 转录调控网络（TRNs）
• 4 讨论
• 4.1 GRNs的提示
• 4.2 基于Pathway映射的发现
• 4.3 从文献网络中挖掘生物学意义
• 4.4 TRNs的预测
• 参考文献
• 第七章 表达谱数据的可靠性评价
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 芯片实验自身的质量控制分析
• 2.2 QRT-PCR验证
• 3 结果与分析
• 3.1 片内重复的平均变异系数（（?））
• 3.2 片间重复的平均相关系数（（?））
• 3.3 QRT-PCR验证结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 第八章 结论和展望
• 1 本文研究总结
• 2 下一步工作的思路和方向
• 参考文献
• 致谢
• 博士在读期间发表的论文