对硝基苯酚降解菌的筛选、鉴定、降解性能与表面疏水性研究

论文摘要

对硝基苯酚（p-nitrophenol, PNP）是一种应用广泛的硝基芳香化合物,主要用于生产合成染料、医药、炸药、工业溶剂以及有机磷农药。它若进入水体,则会造成水体污染,美国环保局已将其列入优先控制的污染物名单中。由其带来的环境污染问题也已受到人们的普遍关注。国内外对利用微生物降解对硝基苯酚进行了较为广泛的研究,对于其主要降解途径有了初步的了解,但鲜有以对硝基苯酚为唯一碳源与氮源并将其完全降解或矿化的高效降解菌的研究报道。本研究应用微生物富集驯化方法,筛选分离到两株对硝基苯酚降解细菌,它们可利用对硝基苯酚为唯一碳源与氮源生长并将其完全转化,对其生长特性、降解能力和降解机理进行研究;并对其降解酶的降解特性进行了探讨。主要研究内容如下:1.从华阳农药厂的污水处理池活性污泥中筛选获得两株能高效降解对硝基苯酚的细菌CN2和CN6,通过形态学、生理生化和16S rDNA序列同源性分析,将其分别鉴定为节杆菌属（Arthrobacter sp. CN2）和红球菌属（Rhodococcus sp. CN6）;其16S rDNA基因序列在GenBank中的注册号分别EU266494和EU266492。2.在纯培养条件下,运用紫外可见分光光度法（UV-Vis）和高效液相色谱（HPLC）法,分别测定了菌株CN6对对硝基苯酚及其降解中间产物4-硝基儿茶酚的降解性能。在pH 7和30℃条件下,细菌CN6能将100mg/L的对硝基苯酚和4-硝基儿茶酚分别在12h和20h内完全降解。并测定了不同接种量、外加碳源、氮源、温度、pH及对硝基苯酚浓度对该菌株降解能力和菌体生长的影响。结果表明:以对硝基苯酚为唯一碳源、接种量0.15～0.3 g/L、温度15～35℃、pH 7～9、对硝基苯酚浓度25～200 mg/L时,该菌株的降解效果较好;外加碳源会显著增强微生物的生长量,而对其降解性能影响不大。外加氮源对菌体的生长以及降解性能都没有明显影响。3.对菌株CN6的降解底物谱进行了研究,发现该菌能以对硝基苯酚或4-硝基儿茶酚为唯一碳源、氮源和能源生长,表明降解过程中可能伴随着苯环的断裂,最终彻底矿化成二氧化碳和水。该菌株还可降解苯酚、甲苯、甲基对硫磷等,具有较为广泛的底物谱,显示出其在污染位点修复中的应用潜力。4.研究了细菌CN6在不同培养条件下的细胞表面疏水性,发现其随着pH的升高而升高,但随着温度的升高反而会降低;在对硝基苯酚浓度增加时,该菌的细胞表面疏水性也会相应提高。说明该菌具有较高的细胞表面疏水性,能够促进菌体吸附对硝基苯酚等有机污染物,从而加速降解利用。5.对细菌CN6粗酶活性的分析表明,粗酶液能将50 mg/L的对硝基苯酚快速降解为无毒物质;细菌CN6的降解酶在pH 7～9和20～40℃活性较高,最适pH 8,降解酶最适温度在30℃;此粗酶液可用于污染位点以及果蔬表面对硝基苯酚残留的快速解毒和清除。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 硝基芳香化合物的微生物降解概述
• 1.1.1 硝基芳香化合物的种类与毒性
• 1.1.2 硝基芳香化合物的降解菌
• 1.1.3 生物降解硝基芳香化合物的代谢方式
• 1.1.4 降解酶的研究与酶制剂的研发
• 1.2 对硝基苯酚的微生物降解研究现状
• 1.2.1 对硝基苯酚污染及其降解微生物
• 1.2.2 对硝基苯酚的生物降解途径与降解基因
• 1.2.3 生物降解对硝基苯酚研究中存在的问题
• 1.3 本研究的内容、目的及意义
• 1.4 本研究的创新点
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 药品试剂
• 2.1.2 仪器设备
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 试剂配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 降解菌的富集驯化与筛选分离
• 2.2.2 降解菌的菌种鉴定及系统发育分析
• 2.2.3 降解菌的生长特性和降解性能
• 2.2.4 降解菌的底物谱
• 2.2.5 对硝基苯酚降解菌细胞表面疏水性测定
• 2.2.6 对硝基苯酚降解酶的特性研究
• 3 结果与分析
• 3.1 对硝基苯酚降解菌的分离与鉴定
• 3.1.1 菌株的形态学观察
• 3.1.2 菌株的生理生化特性
• 3.1.3 菌株的16S rDNA 系统发育分析
• 3.1.4 对硝基苯酚降解菌的系统发育进化分析
• 3.2 菌株的生长特性及降解性能研究
• 3.2.1 菌体生长与对硝基苯酚残留量的测定
• 3.2.2 菌株CN6 的降解性能分析
• 3.2.3 对硝基苯酚降解菌的底物谱
• 3.3 对硝基苯酚降解菌细菌表面疏水性测定
• 3.3.1 两相分离系统的选择
• 3.3.2 培养条件对降解菌表面疏水性的影响
• 3.4 对硝基苯酚降解酶的特性研究
• 3.4.1 粗酶液的降解性能
• 3.4.2 温度和pH 对酶促降解的影响
• 4 讨论
• 4.1 具有降解对硝基苯酚能力的微生物
• 4.2 微生物降解对硝基苯酚的途径
• 4.3 对硝基苯酚降解酶的分离纯化
• 4.4 对硝基苯酚降解菌的细胞表面疏水性
• 5 结论
• 下一步工作设想
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间完成论文