昆虫抗冻蛋白基因转化烟草抗寒性功能的研究

论文摘要

抗冻蛋白（AFP）是广泛存于各种生命体中的一种高效抗冻活性物质,它能以非依数的形式（冰晶的熔点温度与其生长点温度不具有相同的变化）降低水溶液的冰点而对熔点影响甚微,因而保护多种有机体免受结冰引起的伤害,其抗冻活性通常定义为热滞值,大小用热滞系数表示。比较来源不同的多种抗冻蛋白的热滞活性,昆虫抗冻蛋白的热滞值最高为3～6℃,因而昆虫抗冻蛋白基因目前越来越多地做为提高植物抗寒性转化的首选基因。本实验室从新疆极地荒漠昆虫准噶尔小胸鳖甲中克隆了抗冻蛋白基因MpAFP149 （含信号肽）,它编码120个氨基酸残基,分子量大小为12.7 kDa。去除信号肽的成熟肽含有98个氨基酸,理论分子量大小为10.2 kDa。在成熟的蛋白质序列中,一级结构由l2个氨基酸TCTxSxxCxxAx （X表示其它的任意氨基酸残基）的TXT重复序列组成,每隔6个氨基酸残基,就有一个半胱氨酸重复,除了第一和第二个重复序列,其他重复单位中的每两个半胱氨酸形成一个二硫键。本试验中我们构建了含有MpAFP149基因的不同植物表达载体,采用不同的转化方式转化模式植物烟草,试探讨新疆荒漠昆虫抗冻蛋白基因在植物体内的抗寒功能及提高昆虫抗冻蛋白在植物体内表达和热滞活性的几种途径和方法。以高效的烟草核转化体系为平台,构建了含有新疆准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白基因MpAFP149的核单价植物表达载体,通过叶圆盘法转化模式植物烟草,获得了2株转录水平较高的T1代转基因植株T1-5和T1-39。在-1℃处理1 d、2 d和3 d的抗寒实验中,转基因烟草的抗寒能力明显优于野生型烟草。当低温处理1 d时,转基因烟草和对照野生型烟草的离子外渗率都有一定程度的上升但差异不大。当低温处理延长至2 d时,野生型烟草的电导率达到65%,而转基因烟草T1-5和T1-39的相对电导率仅分别为28%和27%。当处理第三天时,相对电导率的增长趋势与第二天相似,野生型烟草、T1-5和T1-39的相对电导率分别为71%,28%和36%。丙二醛是反应植物细胞膜脂过氧化程度的一个指标,它含量的变化可间接反应相对电导率的变化。冷处理前,野生型和转基因烟草的丙二醛差异不大,但随着低温处理时间的延长,野生型烟草的丙二醛含量是转基因烟草丙二醛含量的3倍。结果表明野生型烟草遭受了比转基因烟草更为严重的膜脂氧化伤害。同时丙二醛和相对电导率的含量都随着低温处理的延长而增加,二者之间存在明显的相关性,相关系数为R2=0.9132,这表明相对电导率的提高是由于低温引起的膜脂过氧化造成的。T1代单价转基因烟草（pCAMBIA1302-MpAFP149）在低温下的表型及生理生化结果进一步揭示了准噶尔小胸鳖甲昆虫抗冻蛋白MpAFP149能够赋予植物一定程度的耐寒性。国外学者在体外试验中发现,小分子物质柠檬酸可提高昆虫抗冻蛋白的热滞活性,柠檬酸是抗冻蛋白的增强剂。为了进一步提高抗冻蛋白在植物体内的热滞活性,利用RT-PCR技术扩增了烟草柠檬酸合成酶基因tacs,使其构建至单价植物表达载体pCAMBIA1302-MpAFP149中,最终构建成一个同时含有MpAFP149和烟草柠檬酸合成酶基因tacs的植物双价表达载体pCAMBIA1302-MpAFP149-tacs,转化至农杆菌EHA105中。利用叶圆盘法转化烟草,获得了T1代双价转基因烟草。对T1代单价和双价转基因烟草进行了体外-1℃低温试验,转基因烟草的表型明显优于野生型烟草,但单双价转基因烟草之间的表型差异不大。室温恢复中,转基因烟草可恢复生长并仍能存活,而野生型烟草已造成了不可逆的低温伤害。试验结果表明含有昆虫抗冻蛋白基因MpAFP149的单双价转基因烟草均表现出比野生型烟草较强的抗寒能力,但柠檬酸在植物体内未能协同抗冻蛋白进一步提高双价转基因烟草的抗寒性。由于叶绿体基因工程能有效解决当前转基因植物中外源基因表达量过低的问题,因而构建了抗冻蛋白基因MpAFP149的叶绿体表达载体,转化植物,旨在提高异源蛋白在植物中的表达量,从而进一步提高植物的耐寒性。根据已构建的大豆叶绿体表达载体,设计特异性引物,将昆虫抗冻蛋白基因MpAFP149插入此载体中,利用基因枪轰击法,转化烟草,经500 mg/L壮观霉素的反复多轮筛选获得四株转基因株系。在-1℃抗寒表型实验中,叶绿体型转基因烟草的耐寒性优于野生型烟草,与核转化的T1代单价转基因烟草抗寒性差别不大,推测可能是由于异源基因MpAFP149在烟草叶绿体基因组中同质化程度较低所造成。通过激光扫描共聚焦和免疫胶体金技术显示异源抗冻蛋白MpAFP149主要表达在转基因植物质外体空间的细胞壁上。透射电镜对-1℃连续三天低温处理的细胞器形态学变化进行比较,转基因烟草和野生型烟草的超微结构存在差异,尤其表现在细胞膜、叶绿体和线粒体的膜上。这种超微结构差异可能是由于异源表达的抗冻蛋白与细胞壁间发生相互作用,同时降低了植物细胞的冰点,因而抑制了质外体中冰晶的生长稳定了膜系结构,避免了细胞的冻害,最终提高了转基因烟草细胞的冷耐受性。总之本试验获得的转基因烟草在-1℃抗寒实验中均比野生型烟草表现一定的抗寒能力,说明此昆虫抗冻蛋白基因MpAFP149无需进行密码子优化就可有效地在植物体内进行正确表达,可以做为今后转化作物的抗寒首选基因。该结果为减轻新疆冷敏感经济作物棉花在春季遭受冻害及葡萄冬季掩埋等问题提供了理论依据和应用基础。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 文献综述
• 第一章昆虫抗冻蛋白的研究进展
• 1 昆虫抗冻蛋白的特点
• 1.1 抗冻活性高
• 1.2 结构规律
• 2 昆虫抗冻蛋白的生物学活性研究
• 2.1 抗冻蛋白的热滞活性检测
• 2.2 昆虫抗冻蛋白的抗冻活性及影响因子
• 2.3 昆虫抗冻蛋白作用机制的研究
• 3 昆虫抗冻蛋白的应用
• 3.1 抗冻蛋白在食品工业中的应用
• 3.2 抗冻蛋白在医学上的应用
• 3.3 抗冻蛋白的基因工程研究与应用
• 4 结论与展望
• 参考文献
• 第二章 植物抗寒性及抗寒基因工程研究进展
• 1 低温引起植物的膜脂相变及转脂肪酸去饱和酶基因的研究
• 2 抗氧化系统对低温胁迫的生化响应及转抗氧化酶的研究
• 3 渗透调节物质的积累及转抗渗透胁迫相关基因
• 4 低温信号转录因子的表达及转抗寒调控基因
• 5 低温诱导蛋白及转冷诱导基因的研究
• 6 具有热滞活性的植物抗冻蛋白及转抗冻蛋白基因的研究
• 7 结论与展望
• 参考文献
• 第二部分 研究正文
• 第一章 烟草高效转化体系的建立
• 引言
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 无菌苗的获得
• 1.3 潮霉素临界值的确定
• 1.4 农杆菌的培养
• 1.5 烟草的转化
• 1.6 浸染时间的确定
• 1.7 生根培养基的确定
• 1.8 转基因植株的PCR 检测
• 1.9 烟草种子对潮霉素敏感值的确定
• 2 结果与分析
• 2.1 潮霉素浓度对分化的影响
• 2.2 浸染时间对转化的影响
• 2.3 生根筛选培养基的确定
• 2.4 抗性植株的PCR 检测
• 2.5 潮霉素浓度对烟草种子萌发的影响
• 3 讨论
• 参考文献
• 第二章 抗冻蛋白基因 MpAFP149 表达载体的构建及抗血清的制备
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 生化试剂
• 1.3 抗冻蛋白MpAFP149 基因真核表达载体的构建与鉴定
• 1.4 原核表达载体pGEX-4T-1-MpsAFP149 的构建
• 1.5 融合蛋白在大肠杆菌中的诱导表达和纯化
• 1.6 抗血清的制备
• 1.7 Western blot 检测
• 2 结果与分析
• 2.1 真核表达载体pcDNA3-MpAFP149 的构建
• 2.2 抗冻蛋白MpsAFP149（不含信号肽）原核表达载体的构建
• 2.3 pGEX4T-1-MpsAFP149 原核表达条件的优化
• 2.4 抗冻蛋白的Western blot 检测
• 3. 讨论
• 参考文献
• 第三章 昆虫抗冻蛋白基因转化烟草抗寒性的研究
• 引言
• 第一节 昆虫抗冻蛋白基因单价植物表达载体构建及转化烟草抗寒性研究
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 试剂及仪器
• 1.3 昆虫抗冻蛋白的软件预测分析及瞬时表达
• 1.4 单价植物表达载体的构建
• 1.5 烟草的遗传转化及再生植株的检测
• 1.6 免疫胶体金
• 1.7 westernblots
• 1.8 转基因烟草的抗寒性检测
• 1.9 低温下细胞器形态结构的观察
• 2 结果与分析
• 2.1 抗冻蛋白MpAFP149 的结构特性
• 2.2 MpAFP149 基因与GFP 基因融合表达载体的构建
• 2.3 MpAFP149-GFP 融合蛋白在洋葱表皮细胞的亚定位
• 2.4 单价植物表达载体pCAMBIA1302-MpAFP149 的构建
• 2.5 转基因烟草的PCR、PCR-Southern 及RT-PCR 检测
• 2.6 抗冻蛋白MpAFP149 在转基因烟草中的免疫定位及Westernblots
• 2.7 转基因植物的抗寒性检测
• 2.8 相对电导率和丙二醛含量的测定
• 2.9 低温胁迫下抗冻蛋白对烟草亚细胞结构的影响
• 3 讨论
• 第二节 昆虫抗冻蛋白基因双价植物表达载体构建及转化烟草抗寒性研究
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 生化试剂
• 1.3 双价植物表达载体的构建
• 1.4 植物双价表达载体的农杆菌转化及鉴定
• 1.5 烟草叶片组织的遗传转化
• 1.6 转基因烟草T1 代种苗的筛选
• 1.7 再生植株的分子生物学检测
• 1.8 柠檬酸合成酶的测定
• 1.9 转基因烟草的抗寒实验
• 2 结果与分析
• 2.1 扩增烟草柠檬酸合成酶基因
• 2.2 含有柠檬酸合成酶基因的单双价植物表达载体的构建
• 2.3 转基因烟草的PCR 检测
• 2.4 烟草柠檬酸合成酶活力的测定
• 2.5 转基因植物的抗寒实验
• 3 讨论
• 第三节 昆虫抗冻蛋白基因叶绿体表达载体构建及转化烟草抗寒性研究
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 叶绿体植物表达载体的构建
• 1.3 基因枪转化和转基因的获得
• 1.4 转基因植株的PCR 检测
• 1.5 转基因烟草的RT-PCR 分析
• 1.6 转基因烟草的抗寒性检测
• 2. 结果与分析
• 2.1 叶绿体表达载体的构建与鉴定
• 2.2 转基因植株的获得及PCR 检测
• 2.3 转基因植株的RT-PCR 检测
• 2.4 转基因植株的抗寒性检测
• 3 讨论
• 参考文献
• 第三部分 结论与展望
• 附录1 英文缩略语
• 附录2 主要实验仪器
• 个人简介
• 博士及硕士期间已发表和待发表的论文
• 致谢