酿酒酵母Pdr5p对麦角甾醇代谢的影响及其机制研究

论文摘要

真菌耐药性已成为真菌感染治疗上一个日益严峻的问题,由于麦角甾醇是真菌细胞膜上独特的脂类成分（在哺乳动物细胞膜中不含麦角甾醇而只含胆固醇）,因此一直被作为设计抗真菌药物的最佳靶标之一真菌细胞中的脂类（包括麦角甾醇）合成后转运到细胞膜的途径有两种：小泡转运和非小泡转运。非小泡转运及其调控机制一直没有清楚阐述,近期的研究发现：ABC转运蛋白（ATP-binding cassette transporter）,除了具有结合和外排底物分子（包括药物分子）的泵功能外,还与细胞中脂类的转运、代谢有着密切关系。本论文利用模式真菌细胞酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）,初步研究了其中重要的ABC转运蛋白Pdr5p对酵母细胞膜中麦角甾醇水平调节的机制。首先,论文通过同源双交换的方法分别构建pdr5、pdr10,yorl敲除菌株。耐药性实验表明敲除PDR5会导致菌株对氟康唑的抗性下降,但是对多烯药物两性霉素B的抗性上升。由于两性霉素B与酵母细胞膜上的麦角甾醇结合形成孔道,使细胞内的物质外流导致死亡,本论文通过高效液相色谱方法分析了pdr5敲除菌株中细胞膜上的麦角甾醇含量,发现较野生菌株下降约30%,但pdrl0,yorl单敲菌株的细胞膜麦角甾醇含量均未发生显著改变。说明Pdr5p对麦角甾醇的影响不是ABC转运蛋白家族的共有特性。在此基础上,论文通过实时荧光定量PCR方法研究了敲除PDR5后对麦角甾醇合成、转运途径上的基因及其它一些相关基因在转录水平上表达量的影响。研究发现麦角甾醇合成基因ERG3的表达下调,参与麦角甾醇酯化的基因ARE2表达上调,将酯化麦角甾醇水解为游离麦角甾醇的基因YEHl和YEH2的表达量下调。说明pdr5敲除后影响了麦角甾醇从内质网向细胞膜的转运,细胞内麦角甾醇的累积导致ERG3表达下调,以减少麦角甾醇的合成产量；同时还导致ARE2表达上调和YEH1、YEH2表达下调,用以将无法转运的麦角甾醇以酯化的形式存储。OSH蛋白家族在脂类运输过程中发挥转运功能,本论文研究发现敲除PDR5后导致该家族中OSH2的表达上调,由于Osh2p参与了麦角甾醇从内质网到细胞膜的转运,该结果暗示在转运麦角甾醇的过程中Pdr5p具有与Osh2p相似的转运功能。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 縮词列表
• 第一章 绪论
• 1.1 各类抗真菌药物作用机制及耐药机制
• 1.1.1 抗真菌药物的作用机制
• 1.1.2 真菌耐药机制
• 1.2 ABC蛋白家族
• 1.2.1 ABC蛋白家族的分布及组成
• 1.2.2 ABC蛋白的结构
• 1.2.3 ABC转运蛋白的作用机制
• 1.2.4 人类ABC转运蛋白--P型糖蛋白（P-gp）
• 1.2.5 酵母ABC转运蛋白
• 1.2.6 PDR5
• 1.3 酵母细胞中的脂类成分
• 1.3.1 麦角甾醇的合成
• 1.3.2 磷脂的合成
• 1.3.3 鞘脂的合成
• 1.3.4 脂类的运输
• 1.4 本文的研究内容
• 第二章 敲除株的构建
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 菌株和质粒
• 2.2.2 实验仪器和设备
• 2.2.3 培养基
• 2.2.4 试剂与溶液
• 2.2.5 酶和生化试剂
• 2.3 敲除株的构建
• 2.3.1 质粒pRS406的提取
• 2.3.2 引物的PCR扩增
• 2.3.3 乙醇沉淀DNA
• 2.3.4 LiAc/SS载体DNA/PEG高效酵母转化法
• 2.3.5 单克隆基因组的提取
• 2.4 实验结果与分析
• 2.4.1 BY4741Δpdr5菌株的构建
• 2.4.2 BY4741Δpdr10菌株的构建
• 2.4.3 BY4741Δyor1菌株的构建
• 第三章 Pdr5p对酵母耐药的影响
• 3.1 前言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 菌种
• 3.2.2 培养基
• 3.2.3 实验仪器和设备
• 3.2.4 耐药实验
• 3.2.5 平板耐药实验
• 3.3 耐药性实验结果
• 3.3.1 BY4741Δpar5菌株对氟康唑的抗性下降
• 3.3.2 BY4741Δpar5菌株菌株对两性霉素B的抗性上升
• 3.4 本章小结
• 第四章 Pdr5p对酵母细胞膜上麦角甾醇的影响
• 4.1 前言
• 4.2 高效液相测定麦角甾醇含量
• 4.2.1 菌株
• 4.2.2 实验仪器和设备
• 4.2.3 培养基
• 4.2.4 放线菌酮诱导Pdr5p过表达
• 4.2.5 麦角甾醇的提取
• 4.2.6 高效液相条件
• 4.2.7 内标法测定麦角甾醇的标准曲线
• 4.3 GC-MS研究麦角甾醇前提的变化
• 4.3.1 麦角甾醇的衍生化
• 4.3.2 GC-MS的条件
• 4.4 高效液相测定麦角甾醇含量结果
• 4.4.1 内标法测定麦角甾醇的标准曲线
• 4.4.2. 敲除PDR5对细胞麦角甾醇含量的影响
• 4.4.3. Pdr5p过表达对细胞麦角甾醇含量的影响
• 4.4.4. PDR10敲除和YOR1敲除对细胞麦角甾醇含量的影响
• 4.5 GC-MS研究麦角固醇及其前体的结果
• 4.6 本章小结
• 第五章 Pdr5p影响酵母细胞膜上麦角甾醇含量的机理初步研究
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 菌株
• 5.2.2 实验仪器和设备
• 5.2.3 生化酶和试剂
• 5.3 实时荧光定量PCR
• 5.3.1 热酚法提取酿酒酵母RNA
• 5.3.2 纯化RNA
• 5.3.3 反转录mRNA成单链cDNA
• 5.3.4 荧光定量PCR反应
• 5.3.5 实验结果分析
• 5.4 实时荧光定量PCR结果
• 5.4.1 敲除PDR5后其他ABC蛋白的表达变化
• 5.4.2 敲除PDR5后麦角甾醇合成途径上相关基因的表达变化
• 5.4.3 敲除PDR5后脂肪酸合成途径上的相关基因的表达变化
• 5.4.4 敲除PDR5后鞘脂合成途径上的相关基因的表达变化
• 5.4.5 敲除PDR5后OSH族在的表达变化
• 5.5 本章小结
• 第六章 总结及展望
• 6.1 论文总结
• 6.2 不足以及对后续工作的建议
• 参考文献
• 致谢