香樟果实酪氨酸酶的分离、纯化和性质分析

论文摘要

酪氨酸酶（ EC 1.14.18.1）是一种含铜的氧化还原酶,它广泛存在于动植物和微生物中,与生物体内的一些色素合成直接相关。酪氨酸酶具有重要的生理生化特征,在医药、环境、食品、精细化工等领域具有广泛的用途。因此,研究酪氨酸酶的分离纯化、酶学性质具有一定的理论和现实意义。通过对几十种植物材料进行粗酶液提取、酶活力测定,确定香樟（Cinnamomum camphora （L.） Presl）果实为实验材料,确定酶活测定体系为:20 mmol/L pH 7.5Tris-HCl缓冲液,10 mmol/L L-DOPA。研究了NAA,PEG,H2O2处理对香樟叶片和果实中酪氨酸酶活性及同工酶的影响,结果表明: 10-4mol/L的NAA对果实成熟以及酪氨酸酶的酶活性都有一定的促进作用;不同的渗透压对香樟酪氨酸酶的形成和活力均呈现不同程度的影响;低浓度的H2O2（1mmol/L）处理可以诱导酪氨酸酶活力提高。香樟果实经过破碎、硫酸铵分级沉淀、Superdex TM200凝胶过滤、DEAE-纤维素阴离子交换色谱分离纯化后,得到一个电泳纯的酪氨酸酶。此酶最适pH值为7.5,最适温度为50℃,亚基分子量为43KDa。以L-DOPA为底物时,Km为12.83 mmol/ L,Vmax为180.65U/mg蛋白。该酶热稳定性较好,在60℃保温1h,仍能保持90%以上的酶活力;该酶在pH4-7的范围内稳定;添加二肽Ala-Asp和Lys-Val在80℃保温30min后,两种二肽均表现出一定程度的保护作用。提纯的香樟果实酪氨酸酶受1mmol/L抗坏血酸和1mmol/Lβ-巯基乙醇, 0.01 mmol/ L Al3+和Cu2+及乌梅提取物的强烈抑制;而0.001mmol/L Zn2+,250mmol/L EDTA和女贞果实提取物则可激活香樟果实酪氨酸酶。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 酪氨酸酶在不同生物中的分布
• 1.2 酪氨酸酶的功能
• 1.2.1 高等植物中酪氨酸酶的生理作用
• 1.2.2 其他生物酪氨酸酶的生理作用
• 1.3 酪氨酸酶的酶学特性
• 1.3.1 不同来源酪氨酸酶的分子特性
• 1.3.2 底物及底物特异性
• 1.3.3 同工酶
• 1.4 外源物质对酪氨酸酶的抑制与激活
• 1.4.1 酪氨酸酶抑制剂的研究进展
• 1.4.2 酪氨酸酶激活剂的研究进展
• 1.5 酪氨酸酶的应用
• 1.6 研究目的和意义
• 1.6.1 研究目的
• 1.6.2 研究意义
• 第二章 实验材料及粗提条件的确定
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 试剂与耗材
• 2.2.3 主要仪器
• 2.2.4 实验材料的预处理
• 2.2.5 酪氨酸酶的提取
• 2.2.6 酶活测定方法的确定
• 2.2.7 蛋白质测定方法
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 材料的确定
• 2.3.2 香樟花、叶、果实酪氨酸酶活力的比较
• 2.3.3 果实发育不同时期酪氨酸酶活力的比较
• 2.3.4 酶活力测定方法的确定
• 2.4 讨论
• 第三章 外源刺激对未成熟香樟果实酪氨酸酶活性及同工酶的影响
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 试剂与耗材
• 3.2.3 主要仪器
• 3.2.4 NAA 对香樟叶片的处理
• 3.2.5 NAA 对香樟果实的处理
• 3.2.6 PEG 对香樟果实的处理
• 2O₂ 对香樟果实的处理'>3.2.7 H₂O₂对香樟果实的处理
• 3.2.8 酶活测定方法
• 3.2.9 同工酶测定方法
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 NAA 处理对香樟叶片酪氨酸酶的影响
• 3.3.2 NAA 处理对香樟果实酪氨酸酶活力的影响
• 3.3.3 NAA 处理对香樟果实同工酶的影响
• 3.3.4 PEG 处理对香樟果实酪氨酸酶活性的影响
• 3.3.5 PEG 处理对香樟果实同工酶的影响
• 2O₂ 对香樟果实酪氨酸酶活性的影响'>3.3.6 H₂O₂对香樟果实酪氨酸酶活性的影响
• 2O₂ 处理对香樟果实同工酶的影响'>3.3.7 H₂O₂处理对香樟果实同工酶的影响
• 3.4 讨论
• 第四章 香樟果实酪氨酸酶的分离纯化
• 4.1 前言
• 4.2 技术路线
• 4.3 材料与方法
• 4.3.1 实验材料
• 4.3.2 试剂与耗材
• 4.3.3 主要仪器
• 4.3.4 硫酸铵分级沉淀
• TM200 柱层析'>4.3.5 Superdex^TM200 柱层析
• 4.3.6 DEAE-纤维素离子交换柱层析
• 4.3.7 酶活测定与蛋白质鉴定
• 4.3.8 纯化倍数与回收率的测定
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 硫酸铵盐析条件的确定
• TM200 柱层析'>4.4.2 Superdex^TM200 柱层析
• 4.4.3 DEAE-纤维素离子交换柱层析
• 4.4.4 不同纯化步骤酶活性
• 4.4.5 电泳鉴定结果
• 4.5 讨论
• 第五章 香樟果实酪氨酸酶酶学特性分析
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 实验材料
• 5.2.2 试剂与耗材
• 5.2.3 主要仪器
• 5.2.4 酶的最适反应条件研究
• 5.2.5 酶的动力学研究
• 5.2.6 香樟果实酪氨酸酶的稳定性研究
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 分子特征
• 5.3.2 最适反应条件
• 5.3.3 反应动力学参数
• 5.3.4 香樟果实酪氨酸酶的稳定性研究
• 5.4 讨论
• 第六章 香樟果实酪氨酸酶的激活与抑制
• 6.1 前言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 实验材料
• 6.2.2 试剂与耗材
• 6.2.3 主要仪器
• 6.2.4 不同金属离子对香樟果实酪氨酸酶酶活性的影响
• 6.2.5 不同化合物对香樟果实酪氨酸酶酶活性的影响
• 6.2.6 不同中药提取物对香樟果实酪氨酸酶酶活性的影响
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 金属离子对香樟果实酪氨酸酶活性的影响
• 6.3.2 化合物对香樟果实酪氨酸酶活性的影响
• 6.3.3 中药提取物对香樟果实酪氨酸酶活性的影响
• 6.4 讨论
• 第七章 结论与展望
• 7.1 结论
• 7.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文