基于GFP标记的镉生物传感器构建及其对镉毒性的检测

论文摘要

利用本实验室保存的两株高抗重金属的细菌为出发菌株，导入gfp标记的质粒构建出两株生物传感器。研究了GFP标记菌株的发光定量方法及其在Cd毒性检测中的应用，主要包括gfp标记工程菌的构建、荧光量与镉离子浓度的关系和发光细菌法在Cd毒性检测中的应用等三个方面。结果如下：1．以E.coli为宿主菌，构建含有CadR-EGFP标记的质粒，并将质粒导入大肠杆菌中，在培养基中加入不同浓度镉进行诱导，当镉离子浓度小于0.05 mM时，荧光强度随启动子效率增加而升高；当镉离子浓度在0.05 mM～0.15 mM时，荧光强度受菌体浓度和启动子效率的双重影响，在曲线上呈现先增加后下降的钟型分布；当镉离子浓度大于0.15 mM时，荧光强度主要取决于细菌的浓度，当细菌浓度达到稳定期时，荧光强度保持不变。2．以E.coli（pHQ21）为对象，检测了在不同土壤固体颗粒存在的情况下，传感器荧光量的变化情况，表明在蒙脱石和高岭石存在情况下，传感器荧光强度下降80％，针铁矿和石英砂对传感器几乎无影响。3．将CadR-EGFP标记抗重金属菌株产气肠杆菌NG01和恶臭假单胞菌X4，并将这两种工程菌投入含有重金属的土壤，进行烟草盆栽试验，荧光显微镜能够监测到土壤中传感器发出的强烈荧光信号，说明该传感器能够检测土壤的镉污染，而且添加传感器的烟草生长明显优于未添加传感器处理的烟草，意味着该传感器还能降低土壤中金属镉对烟草的毒害作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1 微生物抗重金属的机制
• 1.1 生物吸附
• 1.2 代谢累积
• 1.2.1 微生物对重金属的氧化还原
• 1.2.2 输出系统对重金属的作用
• 1.2.3 形成金属硫化物或磷酸盐
• 2 镉生物传感器研究现状
• 3 新型报告基因GFP特点
• 4 GFP蛋白在环境微生物研究中的应用
• 4.1 生物膜和活性污泥
• 4.2 微生物降解及其迁移
• 4.3 作为标记基因研究代谢过程
• 5 本研究的目的
• 材料与方法
• 1 实验材料
• 1.1 菌株与质粒
• 1.2 培养基
• 1.3 试剂
• 1.4 试剂盒和酶
• 1.5 仪器
• 2 实验方法
• 2.1 菌体培养
• 2.2 最低抑菌浓度检测
• 2.3 构建镉响应荧光表达单元
• 2.3.1 EGFP基因的克隆
• 2.3.2 镉响应启动子CadR的克隆
• 2.3.3 诱导验证
• 2.4 镉生物毒性的检测
• 2.4.1 细胞发光量与环境中镉浓度的关系
• 2.4.2 土壤中固体颗粒对细胞发光量的影响
• 2.5 荧光工程菌X4（pHQ311）的构建
• 2.5.1 pX4质粒的测序及分析
• 2.5.2 荧光标记野生质粒pX4
• 2.5.3 将标记过的质粒导入X4
• 2.6 荧光工程菌NTG01（pHQX1）的构建
• 2.7 生物传感器盆栽试验
• 2.7.1 烟草种子的前处理及苗期管理
• 2.7.2 培养用土及处理
• 2.7.3 细胞的处理及接种
• 2.7.4 荧光显微镜观察细菌发光
• 结果与讨论
• 1 两株抗重金属细菌的性质
• 2 特异性镉响应荧光表达单元
• 2.1 克隆绿色荧光蛋白
• 2.2 镉响应调控基因Cad R的克隆
• 3 镉生物毒性的检测
• 3.1 镉响应的生物模型
• 3.2 数学模型结论
• 4 土壤固体颗粒对细胞发光量的影响
• 5 荧光工程菌X4构建
• 5.1 X4菌株野生质粒分析
• 5.2 X4工程菌的构建
• 6 工程菌NTG01的构建
• 7 生物传感器盆栽试验
• 小结
• 参考文献
• 致谢