土槿皮乙酸抑制肿瘤细胞增殖的机制研究

论文摘要

土槿皮乙酸（PAB）是从松科植物金钱松的根皮中分离的二萜酸,具有抗肿瘤、抗生育等作用。本文对土槿皮乙酸体外抗肿瘤活性进行了较为系统的研究,主要阐述了土槿皮乙酸在两种肿瘤细胞:人乳腺癌MCF-7细胞和鼠成纤维肉瘤L929细胞中抑制细胞生长的机制。在人乳腺癌MCF-7细胞中,土槿皮乙酸诱导凋亡,自噬,衰老及M期周期阻滞。土槿皮乙酸在36和48h的IC50分别是3.4和1.35μM。4μM土槿皮乙酸处理36h,MCF-7细胞DNA出现片段化,凋亡小体增加。其凋亡通路主要是土槿皮乙酸激活蛋白酪氨酸激酶（PTKs）,PTKs激活JNK并抑制ERK的活化,进而诱导MCF-7细胞凋亡。但MCF-7细胞的凋亡与Fas死亡受体途径无关。在土槿皮乙酸诱导凋亡的过程中,有一部分细胞因为自噬而逃逸凋亡机制,最终成为衰老的细胞。这部分细胞在4μM土槿皮乙酸作用36h时,MDC染色阳性,Beclin 1表达上调,LC3Ⅰ转变为LC3Ⅱ（自噬）。而在4μM土槿皮乙酸处理3d,去药培养5d的时候存活细胞变大变扁平,SA-β-galactosidase染色为蓝色（衰老）。在研究细胞周期阻滞的过程中,4μM土槿皮乙酸在36h时显著上调细胞核内的cyclinB1和cdc2而诱导M期细胞周期阻滞。同时土槿皮乙酸上调p21和p53的表达,说明p21和p53有可能参与M期周期阻滞和凋亡。而M期周期阻滞有可能与自噬,凋亡和衰老相关。在鼠成纤维肉瘤L929细胞中,土槿皮乙酸不诱导凋亡,但诱导自噬,衰老和M期周期阻滞。80μM土槿皮乙酸在36h的抑制率是65.37±4.12%,但不诱导凋亡小体的出现。而80μM土槿皮乙酸上调Beclin1的表达,增加MDC染色阳性率,促进LC3Ⅰ转变为LC3Ⅱ。说明土槿皮乙酸诱导L929细胞自噬,但不诱导凋亡。在自噬研究中,80μM土槿皮乙酸上调Bax,Bcl-2和Bcl-ⅹL的表达,但不影响线粒体膜电位,主要是因为土槿皮乙酸抑制凋亡蛋白Bax定位在线粒体,而促进抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-ⅹL定位在线粒体。与此同时我们观察到土槿皮乙酸促进胞浆中Bcl-2的磷酸化。免疫沉淀试验显示80μM土槿皮乙酸抑制Bcl-2和Beclin 1的结合,这有可能是因为Bcl-2主要分布在线粒体,而分布在胞浆的Bcl-2被磷酸化,从而降低了其结合Beclin 1的作用,从而促进自噬的发生。在研究caspase与自噬的关系时,发现土槿皮乙酸不激活caspase 8,caspase 9和caspase 3。同时caspase家族抑制剂抑制土槿皮乙酸诱导的自噬,而促进L929细胞的凋亡。在研究细胞周期阻滞的过程中,发现土槿皮乙酸上调细胞核中的cdc2和cyclinB1的表达,说明其诱导的四倍体细胞阻滞于M期。荧光显微镜观察到土槿皮乙酸诱导L929细胞多核的生成。而细胞的M期阻滞和细胞的多核性有可能是土槿皮乙酸作用后L929细胞变大的原因。但土槿皮乙酸与PKC的抑制剂联用后,细胞核内cdc2和cyclinB1的表达降低,也抑制了M期周期阻滞及细胞的多核性的产生。说明土槿皮乙酸在这个过程中激活了PKC。在土槿皮乙酸作用L929细胞3d后,L929细胞不再增殖,同时衰老特异性染色为阳性。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 绪论
• 第一节 土槿皮乙酸药理作用研究进展
• 1.抗真菌作用
• 2.诱导凋亡
• 3.抗生育作用
• 4.抗血管生成作用
• 5.抗微管和周期阻滞作用
• 第二节 细胞凋亡及分子机制研究进展
• 一、细胞凋亡的特征
• 1.形态学和生物化学变化
• 2.凋亡与坏死的区别
• 二、细胞凋亡的一些调控因素
• 1.Caspase蛋白酶与细胞凋亡
• 1.1 Caspase酶原的结构与分类
• 1.2 Caspase的底物
• 2.Bcl-2家族成员在凋亡中的作用
• 3.MAPK家族与凋亡
• 4.细胞凋亡与周期阻滞
• 三、细胞凋亡的信号转导途径
• 1.死亡受体途径
• 1.1 Fas信号途径
• 1.2 TNFR信号途径
• 1.3 DR3、DR4和DR5信号途径
• 2.线粒体途径
• 3.蛋白激酶C信号转导通路
• 第三节 细胞自噬及其分子机制的研究进展
• 一、自噬的分类与自噬体形成的分子基础
• 1.自噬的分类
• 2.自噬体的发生过程
• 2.1 自噬的诱导
• 2.2 自噬体的形成
• 2.3 自噬体的运输、融合
• 2.4 自噬体内再循环利用
• 二、自噬的信号调控
• 1.PI3K对自噬通路的调控
• 2.MAP-LC3在自噬中的功能
• 3.Bcl-2家族蛋白对自噬的调节
• 三、自噬与肿瘤
• 1.自噬与细胞周期
• 2.自噬与凋亡
• 2.1 自噬与凋亡相互促进
• 2.2 自噬与凋亡相互拮抗
• 第四节 细胞衰老及其分子机制研究
• 一、细胞衰老的特征和检验方法
• 二、研究细胞衰老的意义
• 三、细胞衰老的原因和机制研究
• 1.端粒与衰老
• 2.ROS与细胞衰老
• 3.DNA损伤与衰老
• 4.癌基因与衰老
• 5.其他因素
• 四、衰老的信号转到通路
• 五、细胞衰老与细胞周期
• 六、细胞衰老,凋亡与自噬
• 参考文献
• 第二章 土槿皮乙酸诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡,自噬和衰老及对凋亡机制研究
• 第一节 土槿皮乙酸诱导人乳腺癌凋亡、自噬、衰老和M期周期阻滞
• 一、实验材料与方法
• 1.实验材料
• 1.1 细胞
• 1.2 药品与试剂
• 1.3 仪器
• 2.实验方法
• 2.1 土槿皮乙酸对MCF-7细胞生长抑制的影响
• 2.2 细胞形态学变化的观察
• 2.3 荧光染色
• 2.4 细胞死亡方式的判断（LDH活力测定）
• 2.5 DNA片段化电泳
• 2.6 流式细胞分析法
• 2.7 细胞衰老的检测:SA-β-半乳糖苷酶检测法
• 2.8 荧光显微镜和流式细胞仪分析MDC荧光染色
• 2.9 Western印迹法
• 2.10 统计分析
• 二、实验结果
• 1.土槿皮乙酸诱导MCF-7细胞死亡呈明显的时间和剂量依赖性
• 2.土槿皮乙酸对MCF-7细胞形态及细胞核的影响
• 3.乳酸脱氢酶方法（LDH）定量MCF-7细胞凋亡比率
• 4.土槿皮乙酸诱导MCF-7细胞自噬
• 5.土槿皮乙酸诱导MCF-7细胞衰老
• 6.土槿皮乙酸诱导MCF-7细胞细胞周期阻滞
• 7.MCF-7细胞有caspase-3的表达,但不被土槿皮乙酸激活
• 8.土槿皮乙酸降解细胞DNA修复蛋白PARP
• 9.Fas途径不参与土槿皮乙酸诱导的MCF-7细胞凋亡
• 10.土槿皮乙酸上调p21和p53的表达
• 11.土槿皮乙酸诱导M期周期阻滞
• 三、讨论
• 四、小结
• 第二节 土槿皮乙酸诱导MCF-7细胞凋亡通过酪氨酸激酶,JNK和ERK
• 一、实验材料与方法
• 1.实验材料
• 1.1 细胞
• 1.2 药品与试剂
• 1.3 仪器
• 2.实验方法
• 2.1 PAB对MCF-7细胞生长抑制的影响
• 2.2 细胞形态学变化的观察
• 2.3 细胞死亡方式的判断（LDH活力测定）
• 2.4 Western blot
• 二、实验结果
• 1.土槿皮乙酸诱导MCF-7细胞凋亡,但Genistein和AG1024明显抑制土槿皮乙酸作用
• 2.SP600125降低土槿皮乙酸诱导的凋亡率
• 3.PD98059和SB203580对土槿皮乙酸诱导的凋亡的影响
• 4.土槿皮乙酸上调JNK和p-JNK的表达,却降低p-ERK的表达,对ERK,p38和p-p38的表达没有明显的作用
• 5.土槿皮乙酸通过激活MCF-7细胞的PTKs下调JNK和p-JNK的表达,上调p-ERK的表达
• 三、讨论
• 四、小结
• 参考文献
• 第三章 土槿皮乙酸诱导鼠纤维肉瘤L929自噬、衰老和M期周期阻滞
• 第—节 土槿皮乙酸诱导鼠纤维肉瘤L929细胞自噬和衰老
• 一、实验材料与方法
• 1.实验材料
• 1.1 细胞
• 1.2 药品与试剂
• 1.3 仪器
• 2.实验方法
• 2.1 土槿皮乙酸对L929细胞生长抑制的影响
• 2.2 流式细胞仪分析MDC染色
• 2.3 细胞死亡方式的判断（LDH活力测定）
• 2.4 荧光显微镜和流式细胞仪分析（MDC荧光染色）
• 2.5 罗丹明染色分析线粒体膜电位
• 2.6 免疫沉淀法分析Beclin 1与Bcl-2蛋白的结合
• 2.7 细胞衰老的检测:SA-β-半乳糖苷酶检测法
• 2.8 Western印迹法
• 2.9 统计分析
• 二、实验结果
• 1.土槿皮乙酸抑制L929细胞生长并增加MDC染色阳性率
• 2.土槿皮乙酸不诱导L929细胞凋亡,但与3-MA联用促进凋亡
• 3.3-MA抑制土槿皮乙酸诱导的L929细胞MDC染色阳性率增加
• 4.土槿皮乙酸对L929细胞Beclin 1和LC3表达的影响
• 5.土槿皮乙酸对L929细胞线粒体膜电位的影响
• 6.土槿皮乙酸上调L929细胞中的Bcl-2,Bax和Bcl-xl的表达
• 7.土槿皮乙酸抑制Bcl-2和Beclin 1的结合
• 8.土槿皮乙酸抑制Bax定位在线粒体,促进Bcl-xl和Bcl-2定位在线粒体
• 9.土槿皮乙酸诱导L929细胞衰老
• 三、讨论
• 四、小结
• 第二节 Caspase蛋白对土槿皮乙酸诱导鼠纤维肉瘤自噬的影响
• 一、实验材料与方法
• 1.实验材料
• 1.1 细胞
• 1.2 药品与试剂
• 1.3 仪器
• 2.实验方法
• 2.1 Caspase抑制剂对土槿皮乙酸诱导的L929细胞生长抑制的影响
• 2.2 土槿皮乙酸对L929细胞形态的影响
• 2.3 细胞死亡方式的判断（LDH活力测定）
• 2.4 流式分析MDC荧光染色
• 2.5 流式分析细胞周期
• 2.6 Western印迹法
• 2.7 统计分析
• 二、实验结果
• 1.Caspase 8参与土槿皮乙酸诱导的L929细胞自噬
• 2.Caspase 9不参与土槿皮乙酸诱导的L929细胞自噬
• 3.Caspase 3对土槿皮乙酸诱导L929细胞自噬的影响
• 4.Caspase家族抑制剂与土槿皮乙酸联用,促进凋亡抑制自噬
• 三、讨论
• 四、小结
• 第三节 PKC参与土槿皮乙酸诱导的M期细胞周期阻滞
• 一、实验材料与方法
• 1.实验材料
• 1.1 细胞
• 1.2 药品与试剂
• 1.3 仪器
• 2.实验方法
• 2.1 土槿皮乙酸与PKC抑制剂联用后对L929细胞生长抑制的影响
• 2.2 光学显微镜观察L929细胞形态变化
• 2.3 细胞死亡方式的判断（LDH活力测定）
• 2.4 流式细胞分析法
• 2.5 Hoechst染色
• 2.6 Western印迹法
• 2.7 统计分析
• 二、实验结果
• 1.土槿皮乙酸抑制细胞生长,但与PKC抑制剂联用后促进细胞死亡
• 2.与PKC抑制剂联用土槿皮乙酸诱导L929细胞凋亡小体的产生
• 3.土槿皮乙酸诱导四倍体细胞的产生,但staurosporine降低4倍体细胞的比率
• 4.土槿皮乙酸诱导多核细胞的出现,但与staurosporine联用后,多核细胞减少
• 5.Cyclin B1参与土槿皮乙酸诱导的L929细胞M期周期阻滞
• 6.土槿皮乙酸上调cdc2诱导M期周期阻滞
• 7.土槿皮乙酸与staurosporine联用对cyclinB1和cdc2的影响
• 8.P21和p53参与土槿皮乙酸诱导的L929细胞的M期周期阻滞
• 三、讨论
• 四、小结
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历
• 论文发表情况
• 缩略语说明
• 附录