禾谷镰刀菌的分离鉴定、毒素检测及降毒素基因Tri101的表达

论文摘要

小麦赤霉病又称红麦头,由禾谷镰刀孢属真菌引起,是小麦生产上的一种重要病害,对小麦产量影响很大,重病田产量损失可达50%以上。小麦赤霉病主要分布在潮湿和半潮湿区域,尤其是在气候湿润的温带地区发生严重。在国内,小麦赤霉病主要分布在长江流域和沿海麦区,尤其是江苏省发病严重。镰刀菌感染小麦后产生真菌毒素多达数十种,其中主要有单端孢霉烯毒素,包括脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）,玉米赤霉烯酮（ZEN）以及伏马毒素（Fumonisin, FB1）。小麦赤霉病毒素对人畜具有较大的危害性,如何使用生物学方法来降解这些毒素具有重要意义。本文通过HPLC检测技术对江苏省内100个品种的小麦进行产毒力分析,结果表明：所有品种都受到了DON毒素的污染,绝大多数品种受到了ZEN毒素的污染,其中品种3210污染情况最为严重,DON检出量为2060μg/L, ZEN的检出量为3048.88gg/L。从样品3210中成功分离到一株产毒能力强的菌株F3210,经过分子鉴定此菌株与已报道菌株F15具有高度同源性。从所分离的菌株F3210中成功克隆到目的基因Tri101,据报道该基因是一种编码单端孢酶烯3-O-乙酰转移酶（trichothecene 3-O-acetyltransferase）的结构基因,与镰刀菌抵抗自身毒素有关。通过原核和真核表达体系的构建都均能成功表达出目的蛋白。结果表明,经IPTG诱导3小时后的重组表达菌株BL21-pET29a-Tri101表达量最高,表达产物以包涵体形式存在,镍柱纯化时以200mM咪唑浓度最佳。而重组菌株X33-pPICZa-A-Tri101在经过0.5%甲醇诱导后在菌液上清中同样获得表达产物。接下来将进一步改造表达载体以获得有活性的目的蛋白,为深入研究Tri101基因在降毒素过程中的作用以及为抗赤霉病小麦的研究打下基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 本文缩写词
• 第一章 文献综述
• 1 小麦赤霉病及赤霉毒素
• 1.1 赤霉毒素的种类以及危害特征
• 1.3 产毒素镰刀菌遗传结构演变的研究方法
• 1.4 毒素区域分布差异的本质--镰刀菌种群内不稳定性
• 1.5 研究产毒镰刀菌群体内不稳定性的重要性和迫切性
• 2 Tri101基因的国内外研究进展
• 2.1 基因的结构和功能
• 2.2 基因的表达和应用
• 3 研究目的及意义
• 第二章 镰刀菌毒素的检测及高产毒菌株的分离鉴定
• 1 材料方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 不同地区品种小麦的产毒能力
• 2.2 菌株分离及PCR鉴定
• 2.3 分离菌株不同产毒类型的鉴定尝试
• 3 讨论
• 第三章 Tri101基因的克隆及原核表达
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 目的基因的扩增
• 2.2 克隆载体pMD19T-Tri101的酶切分析与鉴定
• 2.3 重组pET29a-Tri101的构建及酶切验证
• 2.4 重组表达菌株的诱导表达及蛋白纯化
• 3 讨论
• 第四章 Tri101的真核表达体系初探
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 目的基因连接pMD19T-vector
• 2.2 真核表达载体构建及酶切验证
• 2.3 电转化酵母的PCR验证
• 2.4 转化菌株的诱导、纯化及SDS—PAGE检测
• 3 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢