论文题目: 纳米羟基磷灰石诱导肝癌细胞死亡的作用靶点及机理研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 生物材料学
作者: 曹献英
导师: 李世普,董长垣
关键词: 纳米羟基磷灰石,肝癌细胞,生长抑制,非凋亡性程序性死亡,内质网
文献来源: 武汉理工大学
发表年度: 2005
论文摘要: 纳米粒了是指尺寸在在1～100nm之间的颗粒材料,其独特的物理化学特性已经引起了人们的极大研究兴趣。纳米技术是推动当今医学发展的主要动力之一,在肿瘤防治方面的工作已成为目前研究的热点。 纳米羟基磷灰石抗肝癌的应用,得到了越来越多的关注。本课题选用均匀沉淀法、溶胶-凝胶法制备了四种不同粒径的纳米羟基磷灰石,并应用激光粒度分析仪、X-射线衍射、傅立叶红外光谱仪、透射电镜及其电子衍射技术对其粒径、结晶度、成分、形貌等进行了表征。结果显示:纳米羟基磷灰石的粒径分别是59.9nm、170.7nm、288.9nm和421.1nm;红外光谱测试含有羟基磷灰石的特征吸收峰;随着粒径的逐渐增大,其结晶度越来越高,相应x-射线衍射的峰值越尖锐;透射电镜观察分散性越差的颗粒,电子衍射环越清晰。 将制备的四种不同粒径的纳米羟基磷灰石,各以三种浓度通过MTT法进行体外抗人肝癌细胞的筛选,结果显示,肝癌细胞对59.9nm的纳米羟基磷灰石高度敏感,为非细胞毒介导的生长抑制效应,抑制率最高可达70%以上,面对人肝细胞的抑制作用明显降低(P<0.01);肝癌细胞对l70.7nm纳米羟基磷灰石比较敏感,但与前者(59.9nm)组比较具有显著性差异(P<O.01)。应用生长曲线及倍增时间测定、集落形成率测定和一般形态学观察,发现59.9nm的纳米羟基磷灰石可使肝癌细胞的生长曲线上升缓慢,倍增时间延长,集落形成减少,这些变化与纳米羟基磷灰石未处理纰比较都具有统汁学的差异(P<O.05);面对肝细胞的作用不明显(P>0.05)。 首次采用透射电镜及其电子衍射技术定性研究了细胞内的纳米羟基磷灰石成分,发现外源性的纳米羟基磷灰石能够进入细胞内,并且首次发现其定位于内质网。进一步应用激光共聚焦显微镜技术定量检测了细胞内质网的变化,结果显示:肝痛细胞的内质网含量低于肝细胞(P<0.01);肝癌痛细胞经纳米羟基磷灰石作用后,内质网的含量降低(P<0.05),而肝细胞则变化不显著(P>0.05)。 应用琼脂糖凝胶电泳、流式细胞仪检测初步排除了肌癌细胞的凋亡,吖啶橙荧光染色、透射电镜观察,首次提出肝癌细胞的死亡方式为非凋亡性程序性死亡,而且与caspase-9的活性升高有关;进一步研究c-myc、p53的mRNA表达,纳米羟基磷灰石抑制c-myc的表达、上调p53的表达,使肝癌细胞阻滞于
论文目录:
摘要
Abstract
缩写词表
第一部分 综述
1.1 纳米技术及其在肿瘤防治上的应用
1.1.1 纳米及其纳米技术
1.1.2 纳米技术与肿瘤预防
1.1.3 纳米技术与肿瘤诊断
1.1.4 纳米技术与肿瘤治疗
1.2 肝癌治疗研究现状
1.3 肝癌实验室研究状况
1.4 结束语
第二部分 纳米羟基磷灰石的制备和表征
2.1 引言
2.2 化学试剂和仪器
2.3 实验方法
2.3.1 均匀沉淀法制备纳米HAP
2.3.2 Sol-gel制备纳米HAP
2.3.3 纳米HAP的性能测试
2.4 实验结果
2.4.1 样品的粒径及分布趋势分析
2.4.2 XRD分析
2.4.3 红外光谱分析
2.4.4 TEM观察形貌及电子衍射分析
2.5 讨论
第三部分 纳米羟基磷灰石体外抗肝癌细胞的敏感性研究
3.1 引言
3.2 试剂和仪器
3.3 实验方法
3.3.1 细胞与材料
3.3.2 细胞抑制率及IC_(50)的检测
3.3.3 细胞生长率及倍增时间测定
3.3.4 集落形成率测定
3.3.5 活细胞观察
3.3.6 固定细胞的Gimsa染色观察
3.3.7 统计学分析
3.4 实验结果
3.4.1 纳米HAP对细胞的抑制作用
3.4.2 纳米HAP对细胞生长率及倍增时间的影响
3.4.3 纳米HAP对克隆原细胞的作用
3.4.4 纳米HAP对细胞一般形态结构的影响
3.5 讨论
第四部分 纳米羟基磷灰石的细胞内定性、定位及亚细胞器的定量研究
4.1 引言
4.2 试剂和仪器
4.3 实验方法
4.3.1 透射电镜观察及电子衍射分析
4.3.2 同步辐射微探针荧光分析
4.3.3 激光扫描共聚焦显微镜检测
4.4 实验结果
4.4.1 纳米HAP的定性及亚细胞器定位分析
4.4.2 细胞内钙元素的定量分析
4.4.3 细胞死亡作用靶点—内质网的定量分析
4.5 讨论
第五部分 纳米羟基磷灰石诱导肝癌细胞死亡机理的初探
5.1 引言
5.2 试剂和仪器
5.3 实验方法
5.3.1 琼脂糖凝胶电泳
5.3.2 流式细胞仪观察
5.3.3 活细胞荧光染色
5.3.4 透射电镜观察
5.3.5 caspase-9活性检测
5.3.6 原位杂交检测
5.4 实验结果
5.4.1 肝癌细胞DNA电泳及DNA含量的变化
5.4.2 纳米HAP诱导肝癌细胞死亡的形态结构变化
5.4.3 纳米HAP对肝癌细胞caspase-9活性的影响
5.4.4 纳米HAP对肝癌细胞的c-myc、p53表达的影响
5.5 讨论
第六部分 结论
参考文献
发表论文
致谢
发布时间: 2005-10-11
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